| تبليغات | X |
نشانگرهای مولکولی جهت نقشه يابي
جستجوی نشانگرهای مولکولی مشکلات مربوط به مطالعه و نقشهیابی ژنوم در گیاهان عالی و در حقیقت مشکلات ژنتیک را حل کرده است. مسأله اصلی در نقشه یابی، محدودیت تعداد نشانگرهای مورفولوژیکی مورد استفاده در ژنتیک کلاسیک میباشد. نشانگرهای مورفولوژیکی ژن ها فقط قسمت کوچکی از ژنوم را پوشش میدهند، بنابراین بعضی از نواحی کروموزومی برای نقشهیابی خارج از دسترس قرار میگیرند. علاوه بر این، صفات مورفولوژیکی نوعی توارث پیچیده دارند که به شدت تحت تاثیر شرایط محیطی قرار میگیرند.
مشکلات مربوط به کمبود نشانگرهای ژنتیکی لازم برای نقشهیابی، به وسیله نشانگرهای مولکولی در DNA و پروتئین، حل شده است. هر پروتئین محصول منحصر به فرد یک ژن است که بیانگر اختصاصی بودن یک ژن معین میباشد. از این رو میتواند به عنوان نشانگر به خدمت گرفته شود. اصول نشانمند کردن DNA بر مبنای آشکارسازی چند شکلیهای مستقیم در سطح ساختار اولیه مولکول DNA میباشد. حضور تعداد زیادی از نشانگرهای مولکولی توزیع شده در همه ژنوم محققان را قادر به ترسیم نقشه ژنهای دلخواه به طور موثر مینماید. نشانگرهای مولکولی آنالیز ژنتیکی فنوتیپهای وابسته به اثرات متقابل مکانهای ژنی مختلف را تهسیل مینمایند. تاکنون نقشه ژنتیکی بر اساس نشانگرهای مولکولی برای بیش از 30 گونه گیاهی ترسیم شده است. نقشه پیوستگی دقیق نشانگرهای مولکولی مربوط به هر ناحیه حامل ژن، برای کلون کردن یک ژن دلخواه و برای تشخیص وجود آن در جمعیت تحت انتخاب، ضروری است. یکی از کاربردهای مهم نشانگرهای مولکولی استفاده از آنها برای مطالعه و تعیین محل استقرار مکانهای ژنی کنترل کننده صفات کمّی (QTL) میباشد، نظیر وزن دانه، اندازه دانه، محتویات پروتئین، زمان گلدهی، و مقاومت به تنش های ویروسی که صفاتی مهم برای انتخاب گیاهان زراعی جهت اصلاح میباشند. البته گاهی اوقات مشکلات زیادی برای دست ورزی آنها در برنامه های انتخاب وجود دارد، زیرا اساس ژنتیکی آنها به خوبی مطالعه نشده است. همچنین استفاده از نشانگرهای مولکولی برای مطالعه روابط فیلوژنتیک و تاکزونومیک مطالعه تنوع سوماکلونال مفید است. گذشته از این نشانگرهای مولکولی برای نشانمند کردن لاینها و ارقام استفاده میشوند و میتوانند فرایند انتخاب را به میزان نسبتاً زیادی تسریع کنند. تکنولوژی مدرن تولید بذر نیازمند توسعه دقیق و راهی سریع برای معرفی هر رقم می باشد. معرفی ارقام بر اساس فنوتیپ نیازمند هزینه و زمان زیادی میباشد. در چنین فرایندهایی تشخیص تغییراتی که به وسیله تاثیر محیط ایجاد میشود و تغییرات واقعی ژنتیکی خیلی مشکل است.
نشانمند کردن مولکولی اجازه میدهد تا مواد کشت شده دارای کیفیت بالاتر و یکنواختی بیشتر باشند و هم چنین برای اهدافی نظیر انتخاب سریع برای آزاد کرن یک رقم جدید میتوانند موارد استفاده قرار گیرد. هر نوع از نشانگرهای مولکولی دارای مزیت و معایبی میباشد. انتخاب هر نشانگر مولکولی وابسته به تکرارپذیری و سادگی کاربرد آن میباشد. بهترین نشانگر برای نقشهیابی، برای استفاده در انتخاب (MAS)، و برای مطالعه روابط فیلوژنتیک و تاکزونومیک، نشانگری است که از لحاظ هزینه، زمان و اعتبار مقرون به صرفه باشد.
پتانسيل بيوتكنولوژي در افزايش بهرهوري از گياهان دارويي
استفاده از تركيبات دارويي مشتق از گياهان، نه تنها قدمت زيادي دارد، بلكه بهدليل عوارض جانبي بيشمار داروهاي شيميايي از يكسو و نارساييهاي متعدد طب نوين در درمان برخي از بيماريها با گذشت زمان، بار ديگر پرورش و توليد گياهان دارويي با رشد قابلتوجهي روبرو شدهاست. در مقالة حاضر سعي شده است تا ضمن معرفي برخي از روشهاي بيوتكنولوژيك مورد استفاده در شناسايي و توليد گياهان دارويي، اهميت اقتصادي متابوليتهاي دارويي مشتق از اين گياهان و ارزش بالاي آنها براي كشورهايي همچون ايران كه داراي تنوع بالايي از گياهان دارويي هستند مشخص شود:
مقدمه
سابقة استفاده از گياهان دارويي به زمانهاي بسيار دور برميگردد؛ بهطوريكه حتي در كتب قديمي مانند انجيل و كتاب مقدس باستاني هند (ودا)، استفاده از برخي گياهان در درمان بيماريها توصيه شده است. اما قدمت استفاده از گياهان دارويي، بهمعني روند رو به كاهش آن در دنياي مدرن امروزي نيست.امروزه در جوامع صنعتي و در بسياري از كشورهاي پيشرفته و درحال توسعه، استفاده از طب سنتي و گياهان دارويي براي حفظ سلامتي، بهدليل افزايش اعتماد مردم به استفاده از اين گياهان، بسيار چشمگير است.
طبق برآوردي كه توسط سازمان بهداشت جهاني ( WHO ) صورت گرفته است، بيش از 80 درصد مردم جهان (نزديك به 5 ميليارد نفر)، براي درمان بيماريها هنوز از داروهاي گياهي استفاده ميكنند. تقريباً يك چهارم داروهاي تهيهشدة دنيا داراي منشأ گياهي هستند كه يا مستقيماً از گياهان عصارهگيري شدهاند و يا بر اساس تركيب گياهي، مدوله و سنتز شدهاند. كار بر روي طب سنتي و استفاده از گياهان دارويي، در سراسر جهان و بهخصوص هند، ژاپن، پاكستان، سريلانكا و تايلند در دست انجام ميباشد. در اروپا و در كشورهايي از قبيل آلباني، بلغارستان، كرواسي، فرانسه، آلمان، مجارستان، هلند، اسپانيا و انگلستان و همچنين تركيه، حدود 1500 گونه از گياهان دارويي و معطر مورد استفاده قرار گرفته و در حدود 1400 محصول گياهي در اروپا و ايالات متحده توليد ميشود. در حدود 25 درصد از داروهاي تجويزشده در ايالات متحده، حاوي حداقل يك تركيب فعال گياهي هستند. در چين، فروش داروهاي سنتي در طول 5 سال اخير دو برابر شده است. در هند نيز صادرات گياهان دارويي نسبت به سالهاي قبل سه برابر شده است. تعداد زيادي از فرآوردههاي دارويي مشهور از گياهان بدست ميآيند. مثلاٌ، معمولترين مسكن، يعني (آسپرين) از گونههاي Salix (بيد) و Spiraea بهدست ميآيد. همچنين داروهاي ضد سرطاني چون Paclitaxel و Vinblastine فقط از منابع گياهي حاصل ميشوند.
بنابراين استفاده از روشهاي بيوتكنولوژيك بهمنظور تكثير و افزايش توان ژنتيكي گياهان دارويي و همچنين شناسايي سريعتر و دقيقتر ژنوتيپهايي كه فرآوردة بيشتري توليد ميكنند، ميتواند بسيار مفيد و از لحاظ تجاري سودآور باشد. در مطلب حاضر، روشهاي مختلف بيوتكنولوژيك كه ميتوانند در زمينة افزايش بهرهوري گياهان دارويي بهكار روند معرفي خواهند شد.
كاربردهاي " كشت بافت " در زمينة گياهان دارويي
|
يكي از بخشهاي مهم بيوتكنولوژي "كشت بافت" است كه كاربردهاي مختلف آن در زمينة گياهان دارويي، از جنبههاي مختلفي قابل بررسي است:
باززايي در شرايط آزمايشگاهي ( In-Vitro Regeneration ):
تكثير گياهان در شرايط آزمايشگاهي، روشي بسيار مفيد جهت توليد داروهاي گياهي باكيفيت است. روشهاي مختلفي براي تكثير در آزمايشگاه وجود دارد كه از جملة آنها، ريزازديادي است. ريزازديادي فوايد زيادي نسبت به روشهاي سنتي تكثير دارد. با ريزازديادي ميتوان نرخ تكثير را بالا برد و مواد گياهي عاري از پاتوژن توليد كرد. گزارشهاي زيادي در ارتباط با بكارگيري تكنيك " كشت بافت " جهت تكثير گياهان دارويي وجود دارد. با اين روش براي ايجاد كلونهاي گياهي از تيرة لاله در مدت 120 روز بيش از 400 گياه كوچك همگن و يك شكل گرفته شد كه 90 درصد آنها به رشد معمولي خود ادامه دادند. براي اصلاح گل انگشتانه، از نظر صفات ساختاري، مقدار بيوماس، ميزان مواد مؤثره و غيره با مشكلات زيادي مواجه خواهيم شد ولي با تكثير رويشي اين گياه از راه كشت بافت و سلول، ميتوان بر آن مشكلات غلبه نمود. چنانكه مؤسسة گياهان دارويي بوداكالاز در مجارستان از راه كشت بافت و سلول گل انگشتانه موسوم به آكسفورد، توانست پايههايي كاملاٌ همگن و يك شكل از گياه مذكور بهدست آورد. از جملة گياهان ديگر ميتوان موارد زير را نام برد: Catharanthus roseus, Cinchona ledgeriana, Digitalis spp, Rehmannia glutinosa, Rauvolfia serpentina, Isoplexis canariensis
باززايي از طريق جنينزايي سوماتيك (غيرجنسي):
توليد و توسعة مؤثر جنينهاي سوماتيك، پيشنيازي براي توليد گياهان در سطح تجاري است. جنينزايي سوماتيك فرآيندي است كه طي آن گروهي از سلولها يا بافتهاي سوماتيك، جنينهاي سوماتيك تشكيل ميدهند. اين جنينها شبيه جنينهاي زيگوتي (جنينهاي حاصل از لقاح جنسي) هستند و در محيط كشت مناسب ميتوانند به نهال تبديل شوند. باززايي گياهان با استفاده از جنينزايي سوماتيك از يك سلول، در بسياري از گونههاي گياهان دارويي به اثبات رسيده است. بنابراين در اين حالت با توجه به پتانسيل متفاوت سلولهاي مختلف در توليد يك تركيب دارويي، ميتوان گياهاني با ويژگي برتر نسبت به گياه اوليه توليد نمود. ازجمله گياهان دارويي كه توانستهاند از آنها جنين سوماتيك بهدست آورند، ميتوان موارد زير را بيان نمود: Podophyllum hexandrum , Bunium persicum, Acacia catechu , Aesculus hippocastanum and Psoralea corylifolia
حفاظت گونههاي گياهان دارويي از طريق نگهداري در سرما:
با تكيه بر كشت بافت و سلول ميتوان براي نگهداري كالتيوارهاي مورد نظر در بانك ژن يا براي نگهداري طولاني مدت اندامهاي تكثير گياه در محيط نيتروژن مايع، اقدام نمود. نگهداري در سرما، يك تكنيك مفيد جهت حفاظت از كشتهاي سلولي در شرايط آزمايشگاهي است. در اين روش با استفاده از نيتروژن مايع (196- درجه سانتيگراد) فرآيند تقسيم سلولي و ساير فرآيندهاي متابوليكي و بيوشيميايي متوقف شده و در نتيجه ميتوان بافت يا سلول گياهي را مدت زمان بيشتري نگهداري و حفظ نمود. با توجه به اينكه ميتوان از كشتهاي نگهداري شده در سرما، گياه كامل باززايي كرد، لذا اين تكنيك ميتواند روشي مفيد جهت حفاظت از گياهان دارويي در معرض انقراض باشد. مثلاً بر اساس گزارشات منتشر شده، روش نگهداري در سرما، روشي مؤثر جهت نگهداري كشتهاي سلولي گياهان دارويي توليدكنندة آلكالوئيد همچون Rauvollfia serpentine , D. lanalta , A. belladonna , Hyoscyamus spp . است. اين تكنيك، ميتواند جهت نگهداري طيفي از بافتهاي گياهي چون مريستمها، بساك و دانة گرده، جنين، كالوس و پروتوپلاست بهكار رود. تنها محدوديت اين روش، مشكل دسترسي به نيتروژن مايع است.
توليد متابوليتهاي ثانويه از گياهان دارويي:
از لحاظ تاريخي، اگرچه تكنيك " كشت بافت " براي اولين بار، در سالهاي 1940-1939 در مورد گياهان بهكار گرفتهشد، ولي در سال 1956 بود كه يك شركت دارويي در كشور آمريكا ( Pfizer Inc ) اولين پتنت را در مورد توليد متابوليتها با استفاده از كشت تودهاي سلولها منتشر كرد. كول و استابو (1967) و هبل و همكاران (1968) توانستند مقادير بيشتري از تركيبات ويسناجين ( Visnagin ) و ديوسجنين ( Diosgenin ) را با استفاده از كشت بافت نسبت به حالت طبيعي (استخراج از گياه كامل) بهدست آورند. گياهان، منبع بسياري از مواد شيميايي هستند كه بهعنوان تركيب دارويي مصرف ميشوند. فرآوردههاي حاصل از متابوليسم ثانويه گياهي ( Secondary Metabolite ) جزو گرانبهاترين تركيب شيميايي گياهي ( Phytochemical ) هستند. با استفاد از كشت بافت ميتوان متابوليتهاي ثانويه را در شرايط آزمايشگاهي توليد نمود. لازم بهذكر است كه متابوليتهاي ثانويه، دستهاي از مواد شامل اسيدهاي پيچيده، لاكتونها، فلاونوئيدها و آنتوسيانينها هستند كه بهصورت عصاره يا پودرهاي گياهي در درمان بسياري از بيماريهاي شايع بهكار برده ميشوند.
راهكارهاي افزايش متابوليتهاي ثانويه گياهي از طريق كشت بافت
1- استفاده از محركهاي ( Elicitors ) زنده و غير زندهاي كه ميتوانند مسيرهاي متابوليكي سنتز متابوليتهاي ثانويه را تحت تأثير قرار داده و ميزان توليد آنها را افزايش دهند. لازم بهذكر است كه اين محركها در شرايط طبيعي نيز بر گياه تأثير گذاشته و باعث توليد يك متابوليت خاص ميشوند.
2- افزودن تركيب اولية ( Precursor ) مناسب به محيطكشت، با اين ديدگاه كه توليد محصول نهايي در نتيجه وجود اين تركيبات در محيطكشت، القاء شود.
3- افزايش توليد يك متابوليت ثانويه در اثر ايجاد ژنوتيپهاي جديدي كه از طريق امتزاج پروتوپلاست يا مهندسي ژنتيك، بهدست ميآيند.
4- استفاده از مواد موتاژن جهت ايجاد واريتههاي پربازده
5- كشت بافت ريشة گياهان دارويي (ريشه، نسبت به بافتهاي گياهي ديگر، پتانسيل بيشتري جهت توليد متابوليتهاي ثانويه دارد)
مثالها
مثالهاي قابل ذكر آنقدر زياد است كه تصور ميشود هر مادهاي با منشاء گياهي، از جمله، متابوليتهاي ثانويه را ميتوان بهوسيلة كشتهاي سلولي توليد كرد: از جمله تركيباتي كه از طريق كشت سلولي و كشت بافت به توليد انبوه رسيده است، داروي ضد سرطان تاكسول است. اين دارو كه در درمان سرطانهاي سينه و تخمدان بهكار ميرود از پوست تنه درخت سرخدار ( Taxus brevilifolia L. ) استخراج ميگردد. از آنجاييكه توليد تاكسول بهدليل وجود 10 هستة استروئيدي در ساختار شيميايي آن بسيار مشكل است و جمعيت طبيعي درختان سرخدار نيز براي استخراج اين ماده بسيار اندك است، لذا راهكار ديگري را براي توليد تاكسول بايد بهكار گرفت. در حال حاضر، براي توليد تاكسول از تكنيك كشت بافت و كشت قارچهايي كه بر روي درخت رشد كرده و تاكسول توليد ميكنند، استفاده ميگردد.
سولاسودين ( Solasodine ) نيز از تركيبات ديگري است كه از طريق كشت سوسپانسيون سلولي گياه Solanum eleganifoliu بهدست ميآيد. از جمله متابوليتهاي ديگري كه از طريق تكنيك كشت بافت و در مقياس تجاري توليد ميشود، شيكونين ( Shikonin ) (رنگي با خاصيت ضد حساسيت و ضد باكتري) است. مثالهاي زير گوياي كارايي تكنيك كشت بافت در توليد متابوليتهاي ثانويه است.
توليد آلكالوئيد پيروليزيدين ( Pyrolizidine ) از كشت بافت ريشة Senecio sp ، سفالين ( Cephaelin ) و امتين ( Emetine ) از كشت كالوس Cephaelis ipecacuanha ، آلكالوئيد كوئينولين ( Quinoline ) از كشت سوسپانسيون سلولي Cinchona ledgerione و افزايش بيوسنتز آلكالوئيدهاي ايندولي با استفاده از كشت سوسپانسيون سلولي گياه
استفاده از بيورآكتورها در توليد صنعتي متابوليتهاي ثانويه
توليد متابوليت ثانوية گياهي با خصوصيات دارويي در شرايط آزمايشگاهي، فوايد زيادي در مقايسه با استخراج اين تركيبات از گياهان، تحت شرايط طبيعي دارد. كنترل دقيق پارامترهاي مختلف، سبب ميشود كه كيفيت مواد حاصل در طول زمان تغيير نكند. درحالي كه در شرايط طبيعي مرتباٌ تحت تأثير شرايط آب و هوايي و آفات است. تحقيقات زيادي در زمينة استفاده از كشتهاي سوسپانسيون و سلول گياهي براي توليد متابوليتهاي ثانويه صورت گرفته است. از جمله ابزارهايي كه براي كشت وسيع سلولهاي گياهي بهكار رفتهاند، بيورآكتورها هستند. بيورآكتورها، مهمترين ابزار در توليد تجاري متابوليتهاي ثانويه از طريق روشهاي بيوتكنولوژيك، محسوب ميشوند. مزاياي استفاده از بيورآكتورها در كشت انبوه سلولهاي گياهي عبارتند از:
1- كنترل بهتر و دقيقتر شرايط خاص مورد نياز براي توليد صنعتي تركيبات فعال زيستي از طريق كشت سوسپانسيون سلولي
2- امكان تثبيت شرايط در طول مراحل مختلف كشت سلولي در بيورآكتور
3- جابجايي و حملونقل آسانتر كشت (مثلاً، برداشتن مايهكوبه در اين حالت راحت است)
4- با توجه به اينكه در شرايط كشت سوسپانسيون، جذب مواد غذايي بهوسيلة سلولها افزايش مييابد، لذا نرخ تكثير سلولها زياد شده و بهتبع آن ميزان محصول (تركيب فعال زيستي) بيشتر ميشود.
5- در اين حال، گياهچهها به آساني توليد و ازدياد ميشوند.
سيستم بيورآكتور براي كشتهاي جنينزا و ارگانزاي چندين گونة گياهي بهكار رفته است كه از آنجمله ميتوان به توليد مقادير زيادي سانگئينارين ( sanguinarine ) از كشت سوسپانسيون سلولي Papaver somniferum با استفاده از بيورآكتور، اشاره كرد. با توجه به اينكه بيورآكتورها، شرايط بهينه را براي توليد متابوليتهاي ثانويه از سلولهاي گياهي فراهم ميآورند، لذا تغييرات زيادي در جهت بهينهسازي اين سيستمها، براي توليد مواد با ارزش دارويي (با منشأ گياهي) همچون جينسنوسايد ( ginsenoside ) و شيكونين صورت گرفته است.
مهندسي ژنتيك
شاخة بعدي بيوتكنولوژي كه در زمينة گياهان دارويي كاربردهاي فراواني دارد، "مهندسي ژنتيك" است. پيشرفتهاي اخير در زمينة ژنتيك گياهي و تكنولوژي DNA نوتركيب، كمك شاياني به بهبود و تقويت تحقيقات در زمينة بيوسنتز متابوليتهاي ثانويه كرده است. قسمت اعظمي از تحقيقات در زمينة متابوليتهاي ثانويه، بهروي شناسايي و دستكاري ژنتيكي آنزيمهاي دخيل در مسير متابوليكي سنتز يك متابوليت ثانويه، متمركز شدهاست. ابزار طبيعي كه در فرآيند مهندسي ژنتيك و در اكثر گونههاي گياهي و بخصوص گياهان دولپه بهكار ميرود، يك باكتري خاكزي بهنام آگروباكتريوم ( Agrobacterium ) است. گونههاي مختلف اين باكتري، مهندسان طبيعي هستند كه بيماريهاي تومور گال طوقه ( Crown Gall Tumour ) و ريشة مويي ( Hairy Root ) را در گياهان سبب ميشوند. تحقيقات نشان دادهاست كه ريشههاي مويي توليد شده بهوسيلة گونهاي از اين باكتري بهنام A. rhizogenes ، بافتي مناسب براي توليد متابوليت ثانويه هستند. به علت پايداري و توليد زياد اين بافتها در شرايط كشت عاري از هورمون، تاكنون گونههاي دارويي زيادي با استفاده از اين باكتري تغيير يافتهاند. كه از آن جمله ميتوان به كشت ريشة مويي گياه دارويي Artemisia annua بهمنظور توليد تركيب دارويي فعال، اشاره كرد.
بنابراين ميتوان ديد كه مهندسي ژنتيك ميتواند بهعنوان ابزاري قدرتمند جهت توليد متابوليتهاي ثانوية جديد و همچنين افزايش مقدار متابوليتهاي ثانويه موجود در يك گياه بهكار رود.
نشانگرهاي مولكولي
بخش مهم بعدي داراي كاربرد فراوان در حوزة گياهان دارويي، "نشانگرهاي مولكولي" است. قبل از اينكه به موارد كاربرد نشانگرهاي مولكولي پرداخته شود، لازم است دلايل لزوم استفاده از نشانگرهاي مولكولي در زمينة گياهان دارويي ذكر شود:
دلايل استفاده از نشانگرهاي مولكولي در زمينة گياهان دارويي:
فاكتورهايي همچون خاك و شرايط آب و هوايي، بقاي يك گونة خاص و همچنين محتواي تركيب دارويي اين گياه را تحت تأثير قرار ميدهند. در چنين حالاتي علاوه بر اينكه بين ژنوتيپهاي مختلف يك گونه تفاوت ديده ميشود از لحاظ تركيب دارويي فعال نيز با هم فرق ميكنند. در هنگام استفادة تجاري، از اين گياه دو فاكتور، كيفيت نهايي داروي استحصالي از اين گياه را تحت تأثير قرار ميدهند:
1- تغيير محتواي يك تركيب دارويي خاص در گياه مورد نظر
2- اشتباه گرفتن يك تركيب دارويي خاص با اثر كمتر كه از گياهان ديگر بهدست آمده است. بهجاي تركيب دارويي اصلي كه از گياه اصلي بهدست ميآيد.
چنين تفاوتهايي، مشكلات زيادي را در تعيين و تشخيص گياهان دارويي خاص، با استفاده از روشهاي سنتي (مرفولوژيكي و ميكروسكوپي)، بهدنبال خواهد داشت. براي روشنشدن موضوع به مثال زير توجه كنيد:
كوئينون يك تركيب دارويي است كه از پوست درخت سينكونا ( cinchona ) بهدست ميآيد. پوست درختان سينكونا كه در جلگهها كشت شدهاند، حاوي كوئيوني است كه از لحاظ دارويي فعال است. گونههاي مشابهي از اين درخت وجود دارند كه بهروي تپهها و زمينهاي شيبدار رشد ميكنند و از لحاظ مرفولوژيكي (شكل ظاهري) مشابه گونههايي هستند كه در جلگهها رشد ميكنند، اما در اين گونهها كوئيون فعال وجود ندارد.
در طول دهههاي گذشته، ابزارهايي كه براي استانداردسازي داروهاي گياهي بهوجود آمدهاند، شامل ارزيابي ماكروسكوپيك و ميكروسكوپيك و همچنين تعيين نيمرخ شيميايي ( Chemoprofiling ) مواد گياهي بودهاند. قابل ذكر است كه نيمرخ شيميايي، الگوي شيميايي ويژهاي براي يك گياه است كه از تجزية عصارة آن گياه بهوسيلة تكنيكهايي چون TLC و HPTLC و HPLC بهدست آمده است. ارزيابي ماكروسكوپيك مواد گياهي نيز بر اساس پارامترهايي چون شكل، اندازه، رنگ، بافت، خصوصيات سطح گياه، مزه و غيره صورت ميگيرد. علاوه بر اين، بسياري از تكنيكهاي آناليز، همچون آناليز حجمي ( Volumetric Analysis )، كروماتوگرافي گازي ( Gas Chromatography )، كروماتوگرافي ستوني ( Column Chromatography ) و روشهاي اسپكتروفتومتريك نيز براي كنترل كيفي و استانداردسازي مواد دارويي گياهي، مورد استفاده قرار ميگيرند.
گرچه در روشهاي فوق، اطلاعات زيادي در مورد يك گياه دارويي و تركيبات دارويي موجود در آن فراهم آيد، ولي مشكلات زيادي نيز بههمراه دارد. مثلاً براي اينكه يك تركيب شيميايي بهعنوان يك نشانگر ( Marker ) جهت شناسايي يك گياه دارويي خاص، مورد استفاده قرار گيرد، بايد مختص همانگونة گياهي خاص باشد، در حاليكه همة گياهان دارويي، داراي يك تركيب شيميايي منحصربهفرد نيستند. همچنين بين بسياري از مولكولهاي شيميايي كه بهعنوان نشانگر و يا تركيب دارويي خاص مدنظر هستند، همپوشاني معنيداري وجود دارد؛ اين موضوع در مورد تركيبات فنولي و استرولي حادتر است.
يكي از عوامل مهم ديگري كه استفاده از نيمرخ شيميايي را محدود ميسازد، ابهام در دادههاي حاصل از انگشتنگاري شيميايي ( Chemical Fingerprinting ) است. اين ابهام، در اثر تجمع مواد مصنوعي در پروفيل شيميايي حادث ميشود. علاوه بر اين، فاكتورهاي ديگري، پروفيل شيميايي يك گياه را تغيير ميدهند. كه از جمله اين فاكتورها ميتوان فاكتورهاي دروني چون عوامل ژنتيكي و فاكتورهاي بروني چون كشت، برداشت، خشككردن و شرايط انبارداري گياهان دارويي را ذكر نمود. مطالعات شيموتاكسونوميكي (طبقهبندي گياهان بر اساس تركيبات شيميايي موجود در گياه) كه بهطور معمول در آزمايشگاههاي مختلف استفاده ميشوند، تنها ميتوانند بهعنوان معيار كيفي در مورد متابوليتهاي ثانويه، مورد استفاده قرار ميگيرند و براي تعيين كمي اين تركيبات، استفاده از نشانگرهاي ويژه (شيميايي) كه بهكمك آن به آساني بتوان گونههاي گياهان دارويي را از يكديگر تشخيص داد، يك الزام است. در اين رابطه، همانطور كه در فوق ذكر شد، در هرگياه يك نشانگر منحصر به فرد را نميتوان يافت. مشكلي كه در شناسايي گونههاي گياهان دارويي با استفاده از صفات مرفولوژيك وجود دارد، وجود نامهاي گياهشناسي متفاوت در مورد يك گياه در نواحي مختلف جهان است. در اين حالت ممكن است گونههاي گياهان دارويي نادر و مفيد، با گونههاي ديگري كه از لحاظ مرفولوژيكي به گياه اصلي شبيهاند، اشتباه فرض شوند. بنابراين، با توجه به مشكلات موجود در زمينة شناسايي گياهان دارويي با استفاده از روشهاي سنتي و با توجه به پيشرفت محققين در زمينة ايجاد نشانگرهاي DNA ، استفاده از اين تكنيكهاي نوين ميتواند ابزاري قدرتمند در استفاده كارا از گونههاي مؤثر دارويي محسوب شود. از جمله مزاياي اين نشانگرها، عدم وابستگي به سن و شرايط فيزيولوژيكي و محيطي گياه دارويي است. پروفيلي كه از انگشت نگاري DNA يك گياه دارويي بهدست ميآيد، كاملاً به همان گونه اختصاص دارد. همچنين براي استخراج DNA بهعنوان مادة آزمايشي در آزمايشات نشانگرهاي مولكولي، علاوه بر بافت تازه، ميتوان از بافت خشك نيز استفاده نمود و از اين رو، شكل فيزيكي نمونه براي ارزيابي آن گونه، اهميت ندارد. نشانگرهاي مختلفي بدين منظور ايجاد شدهاند كه از آن جمله ميتوان به روشهاي مبتني بر هيبريداسيون (مانند RFLP )، روشهاي مبتني بر RCR (مانند AFLP ) و روشهاي مبتني بر توالييابي (مانند ITS ) اشاره كرد.
برخي موارد كاربرد نشانگرهاي DNA در زمينة گياهان دارويي:
ارزيابي تنوع ژنتيكي و تعيين ژنوتيپ ( Genotyping ):
تحقيقات نشان داده است كه شرايط جغرافيايي، مواد دارويي فعال گياهان دارويي را از لحاظ كمي و كيفي، تحت تأثير قرار ميدهد. بر پاية تحقيقات انجام شده، عوامل محيطي محل رويش گياهان دارويي در سه محور زير بر آنها تاثير ميگذارد:
1- تاثير بر مقدار كل مادة مؤثرة گياهان دارويي
2- تاثير بر عناصر تشكيل دهندة مواد مؤثره
3- تاثير بر مقدار توليد وزن خشك گياه
عوامل محيطي كه تاثير بسيار عمدهاي بر كميت و كيفيت مواد مؤثرة آنها ميگذارد عبارتنداز نور، درجه حرارت، آبياري و ارتفاع محل. بنابراين نياز است كه بهدقت اين موضوع مورد بررسي قرار گيرد. به اين خاطر، بسياري از محققين، تأثير تنوع جغرافيايي بر گياهان دارويي را از لحاظ تغييرات در سطوح مولكول DNA (ژنتيك) مطالعه نمودهاند. اين برآوردها از تنوع ژنتيكي ميتواند در طراحي برنامههاي اصلاحي گياهان دارويي و همچنين مديريت و حفاظت از ژرمپلاسم آنها بهكار رود. از جمله گياهان دارويي كه از نشانگرهاي مولكولي، براي ارزيابي تنوع ژنتيكي در ژرمپلاسم آنها استفاده شده است ميتوان موارد زير را نام برد: Taxus wallichiana , neem, Juniperus communis L., Codonopsis pilosula , Allium schoenoprasum L., Andrographis paniculata
شناسايي دقيق گياهان دارويي
از نشانگرهاي DNA ميتوان براي شناسايي دقيق گونههاي گياهان دارويي مهم، استفاده كرد. اهميت استفاده از اين نشانگرها، بهويژه در مورد گونهها و يا واريتههايي كه از لحاظ مرفولوژيكي و فيتوشيميايي به هم شبيهند، دوچندان ميشود. گاهي ممكن است بر اثر اصلاح گياهان دارويي كالتيوارهايي بهوجود آيد كه هر چند از نظر ظاهر با ساير افراد آنگونه تفاوتي ندارد ولي از نظر كميت و كيفيت مواد مؤثره اختلافهاي زيادي با آنها داشته باشد. در اين حالت اصلاحكنندگان چنين گياهاني بايد تمام مشخصات آن كالتيوار را از نظر خصوصيات مواد مؤثره ارايه دهند كه شناسايي و معرفي خصوصيات مذكور مستلزم صرف هزينه و زمان زياد از نظر كسب اطلاعات گسترده دربارة فرآيندهاي متابوليسمي گياه مربوطه است. بهعلاوه امكان تغييرپذيري وضعيت توليد و تراوش مواد مؤثره در مراحل مختلف رويش گياه همواره بايد مورد نظر اصلاحكننده قرار داشتهباشد. بهعنوان مثال، از نشانگرهاي RAPD و PBR براي شناسايي دقيق گونة P.ginseng در بين جمعيتهاي جينسنگ ( ginseng ) استفاده شده است. همچنين برخي از محققين از يك راهكار جديد بهنام DALP ( Direct Amplification of Length Polymorphism ) براي شناسايي دقيق Panax ginseng و Panax quinquefolius استفاده كردهاند.
انتخاب كيموتايپهاي (hemotypes) مناسب بهكمك نشانگر
علاوه بر شناسايي دقيق گونهها، پيشبيني غلظت مادة شيميايي فعال گياهي ( Active Phytochemical ) نيز براي كنترل كيفي يك گياه دارويي مهم است . شناسايي نشانگرهاي ( DNA QTL ) كه با مقدار آن تركيب دارويي خاص همبستگي دارند، ميتواند جهت كنترل كيفي و كمي مواد خام گياهي، مؤثر واقع شود. لازم بهذكر است كه تنها تفاوت بين كيموتايپهاي مختلف، مقدار مادة شيميايي فعال آنها است. همچنين، پروفيلهاي حاصل از نشانگرهاي DNA ميتوانند جهت تعيين روابط فيلوژنتيكي (خويشاوندي) بين كيموتايپهاي مختلف يك گونه گياه دارويي بهكار روند. در سالهاي اخير مطالعات زيادي بهمنظور تعيين رابطة بين نشانگرهاي DNA و تنوعات كمي وكيفي تركيبات فعال دارويي در بين گونهها و خويشاوندان نزديك گياهان دارويي، صورت گرفته و يا در حال انجام است. از طرفي، بهكارگيري توأم تكنيكهاي مولكولي و تكنيكهاي آناليزي ديگر، چون TLC و HPLC ، ميتواند شناخت ما را نسبت به يك گونة دارويي خاص و به تبع آن كنترل كيفي و كمي تركيب دارويي مورد نظر در سطح صنعتي، افزايش دهد. بهعنوان مثال بررسي تنوع ژنتيكي Artemisia annua ، بهعنوان منبع تركيب ضد ملارياي آرتميزينين ( artemisinin )، نشان ميدهد كه ژنوتيپهاي اين گياه در سراسر هند، از لحاظ محتواي اين تركيب (مقدار مادة مؤثرة آرتمزينين)، تنوع نشان ميدهند. اين بررسي با استفاده از نشانگر RAPD (يك نوع نشانگر DNA ) صورت گرفته است.
اصلاح گياهان دارويي
اگرچه كاشت گياهان دارويي به هزاران سال پيش باز ميگردد ولي بايد گفت كه در مورد اصلاح آنها تاكنون پيشرفت قابل ملاحظهاي صورت نگرفته است و در حال حاضر، تعداد كالتيوارهاي مفيد بهدست آمده بر اثر اصلاح گياهان دارويي اندك است. هدف از اصلاح گياهان دارويي، افزايش كميت و كيفيت آن دسته از مواد مؤثره در اين گياهان است كه در صنايع دارويي از اهميت خاصي برخوردار هستند. در سالهاي اخير توجه خاصي از جانب سازمانهاي مختلف در كشورهاي جهان در ارتباط با اصلاح اين گياهان صورت گرفته است. در اين رابطه، استفاده از نتايج حاصل از انگشتنگاري ( fingerprinting ) مولكولي گياهان دارويي، ميتواند محققين را در پيشبرد اهداف اصلاحي اين گياهان ياري نمايد. از جمله صفات اصلاحي در گياهان دارويي ميتوان موارد زير را نام برد:
مقاومت به آفات و بيماريها، سرعت رشد و نمو اندام محتوي مادة مؤثره (مثلاٌ زودرس بودن ميوه)، دوام كافي اندام مذكور از نظر استحصال (مثلاٌ زود نريختن ميوه و باقي ماندن آن در گياه به مدت كافي)، هماهنگي و همزماني رشد و نمو اندامهاي مورد استحصال (مثلاٌ رسيده شدن همزمان تمامي ميوهها و با هم نبودن ميوههاي كال و رسيده)، قابل جمعآوري بودن محصول با ماشين، فقدان اعضاي مزاحم استحصال چون خارهاي موجود در ساقه، برگ، ميوه و غيره. علاوه بر اينها، در كشت گياهان دارويي ميتوان به توليد انبوه محصول اندامي كه محتوي مقادير بسيار كم از ماده مؤثرة خاصي است، يا (بهعكس) به توليد كمتر از انبوه اندامي كه همان مادة مؤثره را بيشتر تراوش ميدهد توجه نمود.
بهعنوان مثال، مشخص شده است كه نشانگرهاي ISSR-PCR ، تكنيكي مؤثر و كارا براي شناسايي گياهچههاي زيگوتي (گياهچههاي حاصل از تلاقي جنسي) در تلاقيهاي بينپلوئيدي در مركبات است.
استفاده از نشانگرها در زمينة غذاداروها ( Nutraceutical ):
تاكنون نشانگرهاي مولكولي مبتني بر DNA در طيف وسيعي از مطالعات مربوط به گياهان زراعي خواركي استفاده شدهاند. اين موارد استفاده، شامل مطالعة تنوع ژنتيكي، شناسايي ارقام، مطالعات اصلاحي، شناسايي ژنهاي مقاومت به بيماري، شناسايي محل ژنهاي صفات كمي ( QTL )، آناليز تنوع ژرمپلاسم خارجي، شناسايي جنسي گياهان دوپايه و آناليز فيلوژنتيك (روابط خويشاوندي) و غيره هستند. اخيراٌ در نقاط مختلف جهان، استفاده از اين نشانگرها در زمينة غذاداروها رايج شده است. مثلاً، بر اساس قوانين اتحاديه اروپا، مبني بر برچسبگذاري ( Labeling ) غذاها و محصولات تغيير يافتة ژنتيكي ( GMO )، چندين كشور اروپايي همچون آلمان و سوئيس، روشهاي مبتني بر RCR را براي شناسايي و تعيين كمي اين گونه غذاها، در سطح كشور خود توسعه دادهاند. همچنين كشور ايرلند، مؤسسهاي را براي شناسايي فرآوردههاي تغيير يافتة ژنتيكي فاقد مجوز كه در بازارهاي بينالمللي وارد شدهاند و بهطور اخص براي تعيين ذرت تغيير يافتة ژنتيكي با استفاده از تكنيك PCR ، تأسيس نموده است.
پتانسيل اقتصادي گياهان دارويي
طبق برآوردهاي صورت گرفته در سالهاي اخير، ارزش بازارهاي جهاني داروهاي گياهي كه شامل گياهان دارويي و فرآوردههاي آنهاست، همواره با رشد قابل توجهي روبه افزايش بوده است. با توجه به اينكه بخش اعظم بازار گياهان دارويي دنيا، به توليد و عرضة متابوليتهاي ثانوية مشتق از اين گياهان مربوط ميشود، لذا در اين مقاله سعي شده است به اهميت اقتصادي اين تركيبات پرداخته شود. متابوليتهاي ثانويه معمولاً از ارزش افزودة بسيار بالايي برخوردار هستند. بهطوريكه ارزش فروش برخي از اين تركيبات مانند شيكونين، ديجيتوكسين ( Digitoxin ) و عطرهايي همچون روغن جاسمين ( Jasmin )، از چند دلار تا چند هزار دلار به ازاي هر كيلوگرم تغيير ميكند. همچنين قيمت هر گرم از داروهاي ضد سرطان گياهي مانند وينبلاستين ( Vinblastin )، وينكريستين ( Vincristin )، آجماليسين ( Ajmalicine ) و تاكسول ( Taxol ) به چند هزار دلار ميرسد. همانطور كه قبلاٌ اشاره شد، تاكسول يكي از تركيبات دارويي است كه از پوست درخت سرخدار بهدست ميآيد و در درمان سرطانهاي سينه و تخمدان مورد استفاده قرار ميگيرد. آزمايشهاي متعددي براي بررسي اثر اين دارو بر روي انواع ديگر سرطانها مانند سرطان خون، غدد لنفاوي، ريه، روده بزرگ، سر و گردن و غيره در دست انجام است. طبق گزارش اعلام شده از سوي سازمان هلال احمر ايران، ميزان ارز تخصيص يافته براي خريد هر گرم تاكسول تا 5/2 ميليون تومان نيز رسيده است. از آنجاييكه رشد اين درخت بهكندي صورت ميگيرد و منابع دسترسي به اين گياه محدود بوده و براي درمان يك بيمار سرطاني، حدود 28 كيلوگرم از پوست درخت سرخدار لازم است (مقدار مذكور، معادل پوست سه درخت يكصدساله است) ، لذا توليد اين دارو بهروش استخراج از پوست درخت، مقرون بهصرفه نيست. به همين دليل در حال حاضر، اين متابوليت را با استفاده از روش كشت سلولي و در شرايط آزمايشگاهي توليد مينمايند. با اين روش، توليد يك گرم از داروي تاكسول حدود 250 دلار هزينه دارد، در حاليكه با قيمتي حدود 2000 دلار در بازار عرضه ميگردد.
بر اساس آمارهاي موجود، ارزش بازار جهاني داروهاي مشتق از گياهان در سال 2002، با رشد 2/6 درصدي نسبت به سال پيش از آن، به 7/13 ميليارد دلار بالغ گرديد. پيشبيني ميشود اين مقدار در سال 2007 به رقمي معادل 8/18 ميليارد دلار برسد. آمريكا در سال 2002 بيش از 50 درصد اين بازار را به خود اختصاص داده بود. با اين حال انتظار ميرود ارزش اين بازار تا سال 2050 به رقمي معادل 5 تريليون دلار افزايش يابد. نقش بيوتكنولوژي در اين بازار بسيار حايز اهميت بوده است. جدول شمارة (1) و نمودار شمارة (1) ميزان رشد و ارزش بازار اين داروها را نشان ميدهند.
نتيجهگيري
گياهان دارويي، يكي از منابع مهم توليد دارو هستند كه بشر ساليان دراز، از آنها استفاده نموده است و در حال حاضر نيز نهتنها ارزش خود را در زمينة توليد دارو از دست ندادهاند بلكه اهميت آنها نيز فزوني يافته است؛ چنانكه برخي از داروهاي گرانقيمت مانند تاكسول و يا برخي از تركيبات دارويي كه مصرف آنها زياد است مانند آسپرين و ديجيتوكسين، تنها از منابع گياهي بهدست ميآيند.
گياهان دارويي به دليل توأم بودن ماهيت طبيعي و وجود تركيبات همولوگ دارويي در آنها، با بدن سازگاري بهتري دارند و معمولاً فاقد عوارض ناخواسته داروهاي شيميايي هستند، بهخصوص در موارد مصرف طولاني و در بيماريهاي مزمن، بسيار مناسبتر ميباشند. به عنوان مثال، گياهان دارويي در بسياري از اختلالات اعصاب و روان كه تجويز طولاني مدت دارو براي رفع عوارض بيماري، مورد نياز است، بهعنوان بهترين گزينه خواهند بود.
بر اساس آمار موجود، بيشترين داروهاي مصرفي كشور در سال 1380 با تعداد حدود 6/6 ميليارد عدد، مربوط به بيماريهاي اعصاب و روان هستند كه داراي عوارض ناخواسته متعددي نيز ميباشند، درحاليكه بهراحتي ميتوان بخش قابلتوجهي از آنها را با داروهاي گياهي جايگزين كرد . در اين زمينه، روشهاي مهندسي ژنتيك و بيوتكنولوژي ميتوانند بهمنظور افزايش بهرهوري از اين گياهان مورد استفاده قرار گيرند؛ چنانكه كشت بافت با تكثير و حفاظت از ژنوتيپهاي مفيد گياهان زراعي ميتواند مشكل ازدياد و نگهداري به روش سنتي را برطرف سازد. همچنين با استفاده از مهندسي ژنتيك ميتوان گياهان دارويي تراريختهاي بهدست آورد كه ميتوانند متابوليتهاي ثانويه و تركيبات دارويي بيشتر و يا جديدتري را توليد نمايند. علاوه بر اين تحقيقات گستردهاي كه در زمينة كاربرد نشانگرهاي DNA در زمينة گياهان دارويي در مؤسسات تحقيقاتي مختلف جهان در حال انجام است، گوياي توجه محققان به اين ابزارهاي قدرتمند است؛ بهطوريكه در هند كه يكي از دو كشور عمدة توليدكنندة گياهان دارويي در جهان است، چندين دانشكدة كشاورزي و مؤسسة تحقيقاتي در زمينة استفاده از تكنيك هاي مبتني بر DNA ، جهت شناسايي گياهان دارويي، مشغول فعاليت ميباشند. در بسياري از كشورهاي جهان، از سالهاي قبل، برنامههاي مدوني بهمنظور استفادة تجاري از گياهان زراعي تدوين شده است. براي مثال، در سال 1989، وزارت كشاورزي، شيلات و جنگلداري ژاپن پروژهاي تحت عنوان پروژة روح سبز ( Green Spirit Project ) با بودجهاي حدود 110 ميليون ين، از طريق آژانس جنگل خود به اجرا درآورد. هدف از اين برنامه، توليد روغن، رزين و گليكوزيدهاي مهم از بقاياي گياهي همچون چوب، شاخه، برگ و پوست درختان بود. در اروپا، كانادا و آمريكا نيز فعاليتهاي تحقيقاتي و توليدي گستردهاي در زمينة گياهان دارويي انجام شده و يا در حال انجام است كه به دليل كثرت آنها، از معرفي آنها خودداري ميشود.
بنابراين، با توجه به اهميت گياهان دارويي و متابوليتهاي مشتق از آنها در تأمين سلامت جوامع بشري و پتانسيل بالاي اقتصادي اين گياهان، بهعنوان يك منبع درآمد مطمئن، لازم است در كشور ما نيز برنامة مدون و جامعي در اين زمينه تدوين شده و بخشي از تحقيقات بيوتكنولوژي كشاورزي در دانشگاهها و مؤسسات تحقيقاتي بر روي شناسايي، توليد صنعتي و بهينهسازي روشهاي استخراج متابوليتهاي دارويي از اين گياهان اختصاص يابد.
امروزه در جوامع صنعتي و در بسياري از كشورهاي پيشرفته و درحال توسعه، استفاده از طب سنتي و گياهان دارويي براي حفظ سلامتي، بهدليل افزايش اعتماد مردم به استفاده از اين گياهان، بسيار چشمگير است.
طبق برآوردي كه توسط سازمان بهداشت جهاني ( WHO ) صورت گرفته است، بيش از 80 درصد مردم جهان (نزديك به 5 ميليارد نفر)، براي درمان بيماريها هنوز از داروهاي گياهي استفاده ميكنند. تقريباً يك چهارم داروهاي تهيهشدة دنيا داراي منشأ گياهي هستند كه يا مستقيماً از گياهان عصارهگيري شدهاند و يا بر اساس تركيب گياهي، مدوله و سنتز شدهاند. كار بر روي طب سنتي و استفاده از گياهان دارويي، در سراسر جهان و بهخصوص هند، ژاپن، پاكستان، سريلانكا و تايلند در دست انجام ميباشد. در اروپا و در كشورهايي از قبيل آلباني، بلغارستان، كرواسي، فرانسه، آلمان، مجارستان، هلند، اسپانيا و انگلستان و همچنين تركيه، حدود 1500 گونه از گياهان دارويي و معطر مورد استفاده قرار گرفته و در حدود 1400 محصول گياهي در اروپا و ايالات متحده توليد ميشود. در حدود 25 درصد از داروهاي تجويزشده در ايالات متحده، حاوي حداقل يك تركيب فعال گياهي هستند. در چين، فروش داروهاي سنتي در طول 5 سال اخير دو برابر شده است. در هند نيز صادرات گياهان دارويي نسبت به سالهاي قبل سه برابر شده است. تعداد زيادي از فرآوردههاي دارويي مشهور از گياهان بدست ميآيند. مثلاٌ، معمولترين مسكن، يعني (آسپرين) از گونههاي Salix (بيد) و Spiraea بهدست ميآيد. همچنين داروهاي ضد سرطاني چون Paclitaxel و Vinblastine فقط از منابع گياهي حاصل ميشوند.
بنابراين استفاده از روشهاي بيوتكنولوژيك بهمنظور تكثير و افزايش توان ژنتيكي گياهان دارويي و همچنين شناسايي سريعتر و دقيقتر ژنوتيپهايي كه فرآوردة بيشتري توليد ميكنند، ميتواند بسيار مفيد و از لحاظ تجاري سودآور باشد. در مطلب حاضر، روشهاي مختلف بيوتكنولوژيك كه ميتوانند در زمينة افزايش بهرهوري گياهان دارويي بهكار روند معرفي خواهند شد.
گستردگي و تنوع كاربردهاي بيوتكنولوژي، تعريف و توصيف آنرا كمي مشكل و نيز متنوع ساخته است.
برخي آنرا مترادف ميكروبيولوژي صنعتي و استفاده از ميكروارگانيسمها ميدانند و برخي آنرا معادل مهندسي ژنتيك تعريف ميكنند بههمين دليل در اينجا مختصراً اشارهاي به تعاريف متفاوت از بيوتكنولوژي ميكنيم كه البته داراي وجوه اشتراك زيادي نيز هستند:
ـ بيوتكنولوژي مجموعهاي از متون و روشها است كه براي توليد، تغيير و اصلاح فراوردهها، بهنژادي گياهان و جانوران و توليد ميكروارگانيسمها براي كاربردهاي ويژه، از ارگانيسمهاي زنده استفاده ميكند.
ـ كاربرد روشهاي علمي و فني در تبديل بعضي مواد به كمك عوامل بيولوژيك (ميكروارگانيسمها، ياختههاي گياهي و جانوري و آنزيمها) براي توليد كالاها و خدمات در كشاورزي، صنايع غذائي و دارويي و پزشكي
ـ مجموعهاي از فنون و روشها كه در آن از ارگانيسمهاي زنده يا قسمتي از آنها در فرايندهاي توليد، تغيير و بهينهسازي گياهان و جانوران استفاده ميشود.
ـ كاربرد تكنيكهاي مهندسي ژنتيك در توليد محصولات كشاورزي، صنعتي، درماني و تشخيص باكيفيت بالاتر و قيمت ارزانتر و محصول بيشتر و كم خطرتر
ـ استفاده از سلول زنده يا توانائيهاي سلولهاي زنده يا اجزاي آنها و فرآوري و انتقال آنها بهصورت توليد در مقياس انبوه
ـ بهرهبرداري تجاري از ارگانيسمها يا اجزاي آنها
ـ كاربرد روشهاي مهندسي ژنتيك در توليد يا دستكاري ميكروارگانيسمها و ارگانيسمها
ـ علم رامكردن و استفاده از ميكروارگانيسمها در راستاي منافع انسان
ـ تعاريف بالا از بيوتكنولوژي هركدام بهتنهائي توصيف كاملي از بيوتكنولوژي نيست ولي با قدر مشترك گرفتن از آنها ميتوان به تعريف جامعي از بيوتكنولوژي دست يافت.
براستي چرا چنين است؟ هرچند كه با مرور زمان دانشمندان به مفاهيم مشتركي در مورد تعريف بيوتكنولوژي نزديك شدهاند اما چرا هر متخصص و دانشمندي تعريف جداگانهاي از بيوتكنولوژي ارائه ميدهد كه درجاي خود نيز ميتواند صحيح باشد (نه الزاماً جامع). علت اين حقيقت را بايد درماهيت بيوتكنولوژي جُست.
بيوتكنولوژي همانند زيست شناسي، ژنتيك يا مهندسي بيوشيمي يك علم پايه يا كاربردي نيست كه بتوان محدوده و قلمرو آنرا بسادگي تعريف كرد. بيوتكنولوژي شامل حوزهاي مشترك از علوم مختلف است كه در اثر همپوشاني و تلاقي اين علوم بايكديگر بوجود آمده است. بيوتكنولوژي معادل زيست شناسي مولكولي، مهندسي ژنتيك، مهندسي شيمي يا هيچ يك از علوم سنتي و مدرن موجود نيست؛ بلكه پيوند ميان اين علوم در جهت تحقق بخشيدن به توليد بهينه يك محصول حياتي (زيستي) يا انجام يك فرآيند زيستي بروشهاي نوين و دقيق با كارآئي بسيار بالا ميباشد.
بيوتكنولوژي را ميتوان به درختي شبيه كرد كه ريشههاي تناور آنرا علومي بعضاً با قدمت زياد مانند زيست شناسي بويژه زيست شناسي مولكولي، ژنتيك، ميكروبيولوژي، بيوشيمي، ايمونولوژي، شيمي، مهندسي شيمي، مهندسي بيوشيمي، گياهشناسي، جانورشناسي، داروسازي، كامپيوتر و… تشكيل ميدهند ليكن شاخههاي اين درخت كه كم و بيش به تازگي روئيدن گرفتهاند و هرلحظه با رشد خود شاخههاي فرعي بيشتري را بهوجود ميآورند بسيار متعدد و متنوع بوده كه فهرست كردن كامل آنها در اين نوشته را ناممكن ميسازد.
تقسيمبندي بيوتكنولوژي به شاخههاي مختلف نيز برحسب ديدگاه متخصصين و دانشمندان مختلف فرق ميكند و در رايجترين تقسيمبندي از تلاقي و پيوند علوم مختلف با بيوتكنولوژي استفاده ميكنند و نام شاخهاي از بيوتكنولوژي را بدينترتيب وضع ميكنند. مانند بيوتكنولوژي پزشكي كه از تلاقي بيوتكنولوژي با علم پزشكي بوجود آمده است يا بيوتكنولوژي كشاورزي كه كاربرد بيوتكنولوژي در كشاورزي را نشان ميدهد. بدين ترتيب ميتوان از بيوتكنولوژي داروئي Pharmaceutical Biotechnology بيوتكنولوژي ميكروبي، Microbial Biotechnology ، بيوتكنولوژي دريا Marine Biotech ، بيوتكنولوژي قضائي يا پزشكي قانوني Forensic Biotech ، بيوتكنولوژي محيطي Environmental Biotech ، بيوتكنولوژي غذائي food and food stuff Biotech بيوانفورماتيك Bioinformatic ، بيوتكنولوژي صنعتي Industrial ، بيوتكنولوژي نفت … بيوتكنولوژي تشخيصي و … نام برد.
اين شاخههاي متعدد در عمل همپوشانيها و پيوندهاي متقاطع زيادي دارند و باز بدليل ماهيت همهجانبه بودن بيوتكنولوژي نميتوان در اين مورد نيز به ضرس قاطع محدودههائي را براي آنها تعيين نمود.
گستردگي كاربرد بيوتكنولوژي در قرن بيست و يكم بحدي است كه، اقتصاد، بهداشت، درمان، محيطزيست، آموزش، كشاورزي، صنعت، تغذيه و ساير جنبههاي زندگي بشر را تحت تأثير شگرفت خود قرار خواهد داد. بهمين دليل انديشمندان جهان قرن بيست و يكم را قرن بيوتكنولوژي نامگذاري كردهاند.
تاريخچه
بيوتكنولوژي ريشه در تاريخ دارد و تكوين آن از سالهاي بسيار دور آغاز شده تابحال ادامه يافته است.
در تقسيمبندي زماني ميتوان سهدوره براي تكامل بيوتكنولوژي قائل شد.
1) دورة تاريخي كه بشر با استفاده ناخودآگاه از فرآيندهاي زيستي به توليد محصولات تخميري مانند نان، مشروبات الكلي، لبنيات ترشيجات و سركه و غيره ميپرداخت. در شش هزار سال قبل از ميلاد مسيح، سومريان و بابليها از مخمرها در مشروبسازي استفاده كردند. مصريها در چهار هزار سال قبل با كمك مخمر و خمير مايه نان ميپختند. در اين دوران فرآيندهاي ساده و اوليه بيوتكنولوژي و بويژه تخمير توسط انسان بكار گرفته ميشد.
2) دوره اوليه قرن حاضر كه با استفاده آگاهانه از تكنيكهاي تخمير و كشت ميكروارگانيسمها در محيطهاي مناسب و متعاقباً استفاده از فرمانتورها در توليد آنتيبيوتيكها، آنزيمها، اجراء مواد غذائي، مواد شيميائي آلي و ساير تركيبات، بشر به گسترش اين علم مبادرت ورزيد. در آن دوره اين بخش از علم نام ميكروبيولوژي صنعتي بخود گرفت و هماكنون نيز روند استفاده از اين فرآيندها در زندگي انسان ادامه دارد. ليكن پيشبيني ميشود به تدريج با استفاده از تكنيكهاي بيوتكنولوژي نوين بسياري از فرآيندهاي فوق نيز تحت تأثير قرار گرفته و بهسمت بهبودي و كارآمدي بيشتر تغيير پيدا كنند.
3) دوره نوين بيوتكنولوژي كه با كمك علم ژنتيك درحال ايجاد تحول در زندگي بشر است. بيوتكنولوژي نوين مدتي است كه روبه توسعه گذاشته و روز بروز دامنه وسعت بيشتري به خود ميگيرد.
اين دوره زماني از سال 1976 با انتقال ژنهائي از يك ميكروارگانيسم به ميكروارگانيسم ديگر آغاز شد. تا قبل از آن دانشمندان در فرآيندهاي بيوتكنولوژي از خصوصيات طبيعي و ذاتي (ميكرو) ارگانيسمها استفاده ميگردند ليكن در اثر پيشرفت در زيستشناسي مولكولي و ژنتيك و شناخت عميقتراجزاء ومكانيسمهاي سلولي ومولكولي متخصصين علومزيستيتوانستند تا به اصلاح و تغيير خصوصيات (ميكرو) ارگانيسمها بپردازند و(ميكرو) ارگانيسمهائي باخصوصيات كاملاً جديد بوجود آوردند تا با استفاده از آنها بتوان تركيبات جديد را بامقادير بسيار بيشتر و كارائي بالاتر توليد نمود.
كاربردهاي بيوتكنولوژي
كاربردهاي بيوتكنولوژي بقدري وسيع است كه تقريباً تمام جنبههاي زندگي بشر را تحت تأثير قرارداد و خواهد داد. بهنحوي كه حدس زده ميشود در آينده نزديك كنار اكثر نامهاي رايج علوم و فنون يك كلمة «بيو» يا «بيوتك» هم اضافه شود كه نشانه تأثير اين علم بر آن رشته ميباشد.
كاربرد بيوتكنولوژي در كشاورزي يا بيوتكنولوژي كشاورزي « Agbiotech »:
عمدهترين كاربردهاي بيوتكنولوژي در كشاورزي را ميتوان به دستههاي زير تقسيم كرد.
ـ ايجاد گياهان مقاوم به حشرات و آفتها
ـ ايجاد گياهان تحمل كننده علفكشها
ـ ايجاد گياهان مقاوم به بيماريهاي ويروسي و قارچي
ـ ايجاد گياهان مقاوم به شرايط سخت مانند سرما، گرما و شوري
ـ ايجاد گياهان داراي ارزشهاي غذائي ويژه
ـ ايجاد گياهان داراي خاصيت درماني ـ پيشگيري
ـ ايجاد گياهان داراي خصوصيت متابوليكي تغيير يافته مانند رشد سريع و راندمان كشت بالاتر
ـ ايجاد گياهان و ميوههاي داراي زمان ماندگاري بيشتر
ـ ايجاد دامهاي ترانسژنيك كه داراي خصوصيات ويژهاي مانند توليد شير زياد يا گوشت كمچربي و… هستند.
ـ ايجاد جانوراني كه بعنوان كارخانه توليد آنتيبادي و واكسن و دارو عمل كنند
ـ ايجاد ماهيها و ساير دامهائي كه با سرعت زياد رشد ميكنند
گياهان مقاوم به حشرات و آفتها
باتوسعه تكنيكهاي بيوتكنولوژي دانشمندان قادرند ژنهائي از يك موجود زنده را به موجود ديگري انتقال دهند. در سال 1990 اولين گياه ترانسژنيك در مزرعه واقعي كشت گرديد و در 1993 FDA گياهان و غذاهاي ترانسژنيك را بعنوان مواد اساساً بيضرر معرفي كرد.
هماكنون با استفاده از اين تكنيكها ژنهاي مربوط به توليد يك پروتئين سمي (بتاتوكسين) از باكتري باسيلوس تورانجينسيس به گياهان متعددي از قبيل ذرت، پنبه و سيبزميني و… انتقال يافته است و بدينوسيله اين گياهان به حشراتي كه علاقه به تغذيه از آنها را دارند مقاوم گشتهاند. چرا كه بمحض استفاده حشرات از اين گياه بدليل نابودي دستگاه گوارش آنها از بين خواهند رفت.
هرساله هزينههاي هنگفتي بابت مبارزه شيميائي با اين آفات صورت ميگيرد كه علاوه بر هزينهبري زياد آلودگيهاي زيستمحيطي فراواني را بهدنبال دارد. راندمان اين مواد شيميايي نيز بدليل ايجاد مقاومت در حشرات در برابر سموم بمرور پايين آمده است و بهمين خاطر نياز به تعويض مكرر اين آفتكشها وجود دارد.
هماكنون در آمريكا ذرت و پنبه و سيبزميني ترانسژنيك تا ميزان زيادي مورد استقبال واقع شده است بطوريكه تا سال 1998 حدود 18% از ذرت و 17% از پنبه و 4% از سيبزميني كشت داده شده در آمريكا از نوع ترانسژنيك بوده است و هماكنون براساس روند رشد موجود برآورد ميشود كه بيش از 50% غلات كشت داده شده در آمريكا از نوع ترانسژنيك باشند.
گياهان مقاوم به بيماريهاي ويروسي و قارچي
بيماريهاي ويروسي و قارچي از مهمترين بيماريهاي گياهي هستند كه علاوه بر وارد كردن خسارات زياد به محصولات كشاورزي مانع كشت آنها در بسياري از شرايط آب و هوائي ميشود.
باكلون كردن برخي ژنهاي گياهان مقاوم در گياهان حساس مانند ژنهاي كيتنياز و 1 و 3 گلوكاناز كه باعث تخريب ديواره پليساكاريدي قارچهاي پاتوژن ميشوند بيوتكنولوژيستها به گياهاني دست يافتهاند كه مقاوم به قارچهاي پاتوژن ميباشند.
همچنين باكلون كردن ژنهاي جانوري و انجام اقداماتي شبيه واكسيناسيون ميتوان به گياهان مقاوم به ويروس نيز دست يافت. روشهاي مبارزه بيولوژيك بسيار متعدد و متنوع بوده و تنها موارد بالا تنها مثالهائي از اين دست ميباشند.
گياهان مقاوم به علفكشها
روشهاي رايج مبارزه با علفهاي هرز بهنحوي كه بايد انتخابي نيست و علفكشها در موارد زيادي علاوه بر نابودي علفها به گياهان زراعي نيز آسيب ميزنند. بعنوان مثال Glyphosate كه يك علفكش كارآمدي است ميتواند گياهاني را كه داراي سير متابوليكي Shikamate هستند را نيز نابود كند. بهمين منظور بيوتكنولوژيستها با وارد كردن ژن مقاومت گليفوسيت EPSP سنتتاز به گياهاني مانند چغندرقند، سويا، پنبه، گوجهفرنگي و تنباكو آنها را در برابر علفكشها مقاوم كردهاند. (7)
گياهان تحمل كننده شرايط سخت
ارزش گياهاني كه بتوانند در خاكهاي شور با حرارت بالا، سرماي زياد و… رشد كنند بركسي پوشيده نيست. بيش از 13 زمينهاي قابل آبياري جهان داراي درصد غيرقابل تحمل نمك در خود هستند. بيوتكنولوژيستها با بررسي گياهاني كه بصورت خودرو در شرايط سخت مانند فشار اسمزي بالا، سرماي زياد، گرمان فراوان و… رشد ميكنند به ژنهائي دست يافتهاند كه عامل مقاومت اين گياهان در برابر اين شرايط سخت ميباشد. با انتقال اين ژنها گياهان متعددي توليد شدهاند كه قادرند در خاكهاي نامناسب با املاح زياد رشد كنند.
بعنوان مثال با انتقال ژنهاي مسئول انتقال يونهاي سديم بداخل گياهاني مانند آرابيدوپسيس سطح تحمل اين گياه تا 200 ميلي مولار نمك افزايش پيدا كرده است.
همچنين با خاموش كردن سيستم بيان ژنهاي سنتز اسيدهاي چربتري ئنوئيك در گياهان بيوتكنولوژيستها توانستهاند تا اين گياهان را در دماهاي بالاتر از حد معمول رشد دهند.
همچنين با انتقال ژنهاي مسئول توليد نوعي پروتئين ضديخ كه در ماهيهاي آبهاي قطبي يافت ميشود به گياهان بسياري، باعث ايجاد مقاومت در برابر سرماي زياد در اين گياهان شدهاند.
گياهاني كه داراي ارزش ويژهاي هستند
هرمادة با ارزشي كه در درون يك گياه يا هر موجود زنده ديگر ساخته شده و تجمع مييابد بواسطه عملكرد ژنهاي مسئول سنتز آن ماده ميباشد. بيوتكنولوژيستها با شناسائي اين ژنها و افزايش قدرت بيان اين ژنها و يا افزايش تعداد نسخههاي اين ژنها در يك گياه ميتوانند گياهان و ميوههائي كنند كه داراي ارزشهاي غذائي ويژهاي هستند. بهمين سبب اصلاح جديد Nutritional Genomics وضع شده است كه نشان از كاربرد ژنها در بهبود تغذيه انسان و دام دارد. بعنوان مثال «برنج طلائي» برنجي است كه داراي مقادير بسيار زيادي از ويتامين A ميباشد. اين برنج مايه اميدي شده است براي نجات هزاران آفريقائي كه هرساله در اثر كمبود ويتامين A به كوري كامل مبتلا ميشوند.
همچنين بدليل پايين بودن ميكرونوترنيتها در علوفه دامها، انتقال ژنهاي مسئول متراكم ساختن آنها در گياهان علوفهاي نقش مؤثري در تغذيه دامها و انسان خواهد داشت.
گياهاني كه داراي خصوصيت متابوليكي تغيير يافته هستند
افزايش سرعت رشد جمعيت انساني در سالهاي اخير بركسي پوشيده نيست، ليكن افزايش سرعت توليد محصولات كشاورزي پابهپاي آن رشد نكرده است. تا سال 2020 نياز به افزايش 40 درصدي در راندمان كشت برنج وجود دارد. بيوتكنولوژيستها بدو طريق باعث كاهش فاصله اين دو مقوله از يكديگر خواهند شد. اول با افزايش راندمان كشت محصولات كشاورزي در هرهكتار و دوم با افزايش سرعت رشد گياهان.
بعنوان مثال ژنهائي كه مسئول كنترل قد در كوتاه شدن آن در گياهان هستند بطور غيرمستقيم باعث افزايش راندمان محصول ميشوند. با انتقال اين ژنها در گونههاي فاقد آن باعث افزايش راندمان گرديدهاند.
همچنين با انتقال ژنهاي مسئول فتوسنتز در ذرت به برنج توانستهاند راندمان توليد برنج را تا 35% افزايش دهند.
همچنين با دستكاريهاي ژنتيكي در سلولهاي درختاني كه از چوب آنها استفاده ميگردد باعث افزايش سرعت رشد آنها تاحد قابل توجهي شدهاند كه اين امر ميتواند روند تخريب جنگلها را متوقف سازد.
گياهان و ميوههائي كه داراي زمان ماندگاري بيشتر هستند
آيا قبول داريد درصورتيكه ميوههائي مانند گوجهفرنگي زمان ماندگاري بيشتري داشته باشند چقدر در كاهش ضايعات اين ميوه مؤثر خواهد بود. بيوتكنولوژيستها با به تأخير انداختن سرعت رسيدن گوجهفرنگي به اين امر دسترسي پيدا كردهاند.
گياهاني كه داراي خاصيت درماني يا پيشگيري هستند
بيوتكنولوژيستها با انتقال ژنهاي سنتز پروتئينهاي مختلف ميكروبي و انساني به گياهان و توليد اين پروتئينها در گياهان دست به ابتكارات مؤثري زدهاند. بعنوان مثال توليد واكسنهاي مختلف در گياهان و ايجاد ميوههائي كه داراي خاصيت واكسيناسيون هستند. و يا امكان توليد پروتئينهائي مثل انسولين در گياهان كه در آيندة بسيار نزديك به تحقق خواهد پيوست باعث انقلابي در اين زمينه خواهد شد.
همچنين گياهان بعنوان ارگانيسمهاي كانديد براي توليد پروتئينهائي مانند آنتيباديها و آنزيمها و… در مقياس بسيار بالا در نظر گرفته شدهاند و عملاً كارآئي خود را در اين زمينه نشان دادهاند.
حيوانات ترانسژنيك
امروزه بدليل رشد روزافزون جمعيت نياز به مواد غذائي اهميت بيشتري پيدا كرده است و اين اهميت هنگامي بيشتر ميشود كه موضوع كيفيت نيز در كنار آن مطرح شود. بيوتكنولوژيستها با دستكاريهاي بدون ضرر در ژنهاي حيواناتي مانند گوسفند و گاو و ماهي باعث رشد سريع آنها ميشوند. همچنين با دستكاريهاي ژنتيكي ميتوان به گوشت كمچربي و ترد دست يافت كه ارزش غذائي و سلامت بخش آن بسيار بالا باشد.
با انتقال ژنهاي مختلف به اين جانوران ميتوان آنها را غني از مواد خاصي كرد. اخيراً دانشمندان ژاپني با انتقال برخي از ژنهاي گياه اسفناج به خوك موجب توليد گوشتي شدهاند كه داراي برخي خواص استنتاج نيز ميباشد. گاوهاي شيري ترانسژنيك ميتوانند بعنوان كارخانههاي توليد پروتئينها و واكسنها و آنتيباديها عمل كنند. هماكنون اين روش بصورت كاربردي در توليد بسياري از پروتئينها بكار ميرود.
بعنوان مثال گاو ترانسژنيك حامل ژن لاكتوفرين انسان كه يك پروتئين، حاوي آهن و ضروري براي رشد نوزادان است ميتواند باتوليد شير نزديك به شير انسان نيازهاي نوزادان انسان را تاحد زيادي برآورده كند.
يا بعنوان مثال بزهاي ترانسژنيك ميتوانند در هر ليتر شير بيش از چهارگرم آنتيبادي مونوكلونال توليد كنند كه ارزش آن بسيار بالا ميباشد. بدين نحو با جايگزيني تنها 10 بز ترانسژنيك بجاي يك كارخانه بزرگ مدرن ميتوان به يك روش كاملاً اقتصادي دست يافت. (9)
با دستكاري ژنهاي توليد هورمون رشد در ماهيها و افزايش توليد اين هورمون بصورت طبيعي به ماهيهائي دست يافتهاند كه داراي سرعت رشد بسيار بيشتري از گونه مشابه خود هستند.
بيوتكنولوژي پزشكي
كاربرد بيوتكنولوژي در پزشكي به وسعت علم پزشكي بوده و حتي اين علم با سرعت روزافزون بر وسعت و دامنه علم پزشكي ميافزايد.
از مهمترين كاربردهاي بيوتك در پزشكي ميتوان به موارد زير اشاره كرد:
ـ تأثير دگرگون بخش در امر پيشگيري از بيماريهاي ميكروبي، بيماريهاي ژنتيكي، بيماريهاي تغذيهاي و متابوليسمي و بيماريهاي روحيرواني و…
ـ تأثير دگرگون بخش در امر درمان بيماريهاي عفوني، ژنتيكي، سوءتغذيه و متابوليسم و نازائي
ـ تأثير دگرگون بخش در پزشكي قانوني
ـ تأثير دگرگون بخش در پزشكي زيبائي
عناوين مطرح در بيوتكنولوژي پزشكي كه هركدام نياز به توصيف كامل دارند عمدتاً عبارتند از: ژندرماني، واكسنهاي نوتركيب، DNA واكسنها، بيوانفورماتيك، ژنوميكس، پروتئوميكس، بيومدسين و بيوفارماسئوتيكال
امروزه پيشرفتهاي پزشكي به مدد بيوتكنولوژي درحال سرعت گرفتن ميباشد. پزشكي سنتي بتدريج جاي خود را به پزشكي مولكولي خواهد داد. درآينده نهچندان دور مكانيسم هيچ بيماري ناشناخته نخواهد ماند و تقريباً هيچ بيماري غيرقابل كنترل نخواهد بود. پزشكي سنتي عمدتاً بدنبال علائم و نشانهها Sign & Symptoms بيماريها بوده و از روي آن به استنتاج وجود بيماري و عامل بيماريزا ميپرداخت و در مواردي بدليل ناشناخته بودن عوامل بيماريها، مكانيسمها و سيستمهاي كنترلي آنها مبارزه تنها برعليه علائم و نشانهها صورت ميگرفت.
امروزه بكمك بيوتكنولوژي، علم پزشكي درحال شناخت ريشهايترين بخش از حيات و مظاهر آن ميباشد. با كشف كامل توالي ژنوم انسان در سال 2001 هماكنون دانشمندان بيوتكنولوژيست بدنبال شناسائي ژنهاي مسئول صفتهاي مختلف و نيز ژنهاي مسئول نقائص گوناگون انساني ميباشند. تا بهحال ژنهاي مسئول ايجاد بيماريهاي بسياري شامل سرطانها، بيماريهاي قلبي عروقي، تنفسي، رواني و… شناسائي شدهاند.
با شناسائي تكتك اين ژنها و سپس شناسائي پروتئينهاي حاصله از اين ژنها داروهاي كاملاً انتخابي و مؤثر براي مقابله با يك بيماري ساخته ميشوند (tailor made) اين مبارزه در سطح پروتئين و فنوتيپ است راه ديگر مبارزه استفاده از ژندرماني و Antisence است.
بيماريهاي ژنتيكي بسياري درحال حاضر بعنوان كانديد براي ژندرماني درنظر گرفته شدهاند.
تقريباً هركدام از ما تعدادي ژن ناقص در بدن خود داريم كه برخي از آنها خصوصيات خود را در فنوتيب ما آشكار نكردهاند و برخي ديگر كم يا زياد خصوصيات خود را در فنوتيپ ما آشكار نمودهاند تقريباً از هر 10 نفر يكنفر داراي اختلالات ژنتيكي تظاهر يافته ميباشد. تقريباً 5% مراجعه كودكان به بيمارستانها بخاطر نقص در يك تكژن ميباشد.
بيماريهائي مانند سيستيك فيبروزيس، دسيتروفي عضلاني دوشن، بيماري سيستم عصبي هانتينگتون، تالاسمي، هموفيلي، كمخوني داسي شكل، سندروم لش ـ نايهان lesch-Nyhan ، فنيل كتونوري و… جزو كانديداهاي ژن درماني هستند.
بيشتر توجه در ژن درماني متوجه بيماريهاي ژنتيكي - متابوليكي است كه نقص يك ژن باعث عدم سنتز يا سنتز ناقص يك پروتئين و عدم انجام يك فرآيند شيميائي ميشود.
فرآيند ژن درماني ميتواند بر روي سلولهاي سوماتيك بدن صورت گيرد و يا بر روي سلولهاي زايا صورت گيرد كه در اينصورت صفت اصلاح شده به نسل بعد نيز منتقل ميشود.
در فرآيند ژن درماني معمولاً از قطعات ژن سالم ساختگي بهره گرفته ميشود.
تكنولوژي ديگري كه استفاده ميشود آنتي سنس است كه در آن از قطعات اسيدهاي نوكلئيك DNA و RNA يا تركيبات آنالوگ آنها استفاده ميشود و بدينترتيب اتصال احتمالي اين قطعات به محل موردنظر مانع بيان يك ژن ناقص و يا توليد يك پروتئين مضر ميگردد. (10) و (11)
واكسنهاي نوتركيب
ميتوان گفت كه در توليد همهگونه از واكسنها از تكنيكهاي بيوتكنولوژي بهرهگرفته شده و ميشود. ليكن اوج توانمنديهاي بيوتكنولوژي نوين را ميتوان در واكسنهاي نوتركيب نسل چهارم (و نيز DNA واكسنها) مشاهده كرد. تابحال براي توليد واكسنها از ميكروارگانيسمهاي ضعيف شده يا كشته شده يا اجزاء آنها كه بصورت طبيعي از آنها استخراج ميشدند استفاده ميشد و اين امر در موارد قابل توجهي باعث ايجاد عوارض جانبي در افراد ميگرديد. ليكن باتوسعه تكنيكهاي DNA نوتركيب، واكسنهاي نسل چهارم توليد شدند كه در آنها تنها از جزء مؤثر در ايجاد ايمني (جزء ايمونوژن) ميكروارگانيسمها استفاده ميشود. نمونه آن واكسن سابيونيتي مؤثر در برابر هپاتيت B ميباشد.
فرآيند توليد يك واكسن نوتركيب بسيار طولاني و پيچيده ميباشد. در ابتدا بيوتكنولوژيستها بايد ايمونوژنترين جزء ميكروارگانيسمها را كه معمولاً پروتئينها يا گليكوپرتئينهاي غشائي هستند طبق فرآيندهاي بسيار طولاني و پيچيده شناسائي كنند و پس از آن با شناسائي محل و توالي ژن آن در ژنوم ميكروارگانيسم اقدام به تكثير آن بخش كرده و قطعات تكثير شده را درون پلاسميدهاي ويژه كلونينگ قرار دهند و سپس اقدام به انتقال پلاسميدهاي نوتركيب به سلول ميزبان مناسب براي توليد آن پروتئين بنمايند.
درصورت موفقيت در توليد اقتصادي يك پروتئين كانديد براي واكسن يك بانك سلولي و يك بانك پلاسميد از سلولهاي نوتركيب ايجاد شده و ساختارهاي پلاسميدي آنها ايجاد ميشود كه براي مراحل بعد مورد استفاده قرار گيرد.
براي تأييد اين واكسن از نظر مؤثر بودن، كارآئي و بيضرر بودن براي انسان (يا دام) (ClinicalTrials) مراحل زيادي بايد طي شود كه چندين سال بطول ميكشد.
براي توليد صنعتي و تجاري يك واكسن نياز به سرمايهگذاري فراواني ميباشد. بخشي از اين سرمايهگذاري بايد براي ايجاد يك محيط كاملاً استاندارد مطابق با شرايط (Good Manufacturing Practices) GMP و تسهيلات و تأسيسات استاندارد مطابق با GMP و افراد كاملاً متخصص و آموزش ديده و ايجاد يك سيستم با ثبات حفظ كيفيت گردد.
واكسنهاي DNA
با پيشرفت تكنيكهاي بيوتكنولوژي نسل بعدي واكسنها پيشنهاد شدند كه در آنها بجاي توليد بخش ايمونوژن عامل بيماريزا در كارخانهها با ارسال اطلاعات ژنتيكي (DNA) لازم براي توليد اين اجزاء درون سلولهاي بدن به توليد اين ايمونوژنها در بدن پرداخته ميشود. از مهمترين مزاياي اين واكسنها درعين مشكل بودن طراحي و توليد آنها پايدار بودن ايمني حاصله و كنترل بيشتر بر نحوه ايمنيزائي در بدن ميباشد.
بيومدسين يا بيوفارماسئوتيكال
بسياري از بيماريهاي رايج انساني بدليل نقص ژنتيكي در توليد يك پروتئين فانكشنال در سلولهاي بدن ميباشد. اين بيماريها كه شيوع زيادي در جوامع انساني دارند اغلب داراي آثار اقتصادي - اجتماعي بيشتري نسبت به ساير بيماريها هستند. بعنوان مثال بيماريهائي مانند هموفيلي، تالاسمي، كمخونيها، انواع نقصهاي سيستم ايمني، اختلالات رشد و ديابت و…
با پيشرفتهاي اخير در زمينه علوم زيستي بيوتكنولوژيستها قادر شدهاند تا با شناسائي اين اختلالات و ژنهاي مربوطه به توليد پروتئينهايي بپردازند كه بدن اين بيماران قادر به توليد آنها نيست يا ميزان توليد آنها كافي نيست. از جمله اين پروتئينها ميتوان به انواع فاكتورهاي خوني، اريتروپوئيتين، انواع اينترلوكينها، انواع هورمونها مانند انسولين، هورمون رشد اشاره كرد كه درحال حاضر در كارخانههاي بيوتك در مقياس صنعتي درحال توليد هستند. توليد اين پروتئينها هرچند كه هزينهبري زيادي را بهمراه دارد اما باعث كاهش چشمگير مرگومير ناشي از اختلالات ژنتيكي شده است.
بازار توليد اين مواد درحال حاضر بالغ بر ميلياردها دلار است و داراي رشد روزافزوني نيز ميباشد. درحاليكه رشد سالانه صنعت دارو 3% ميباشد، رشد سالانه صنعت داروهاي بيوتكنولوژي 25% ميباشد.
ژنوميكس Genomics
پروژه ژنوم انساني بزرگترين و باارزشترين پروژه در علومزيستي بوده است كه تابحال اجرا شده و در حقيقات منشاء پديد آمدن علم ژنوميكس نيز محسوب ميشود. HGP باهدف تعيين توالي ژنوم (محتواي ژنتيكي) انسان در سال 1996 شروع شده و درسال 2001 با اتمام نسخه اوليه به اوج خود رسيد . با كامل شدن پروژه ژنوم انسان دانشمندان به محل دقيق ژنهاي انسان پيخواهند برد و با شناسائي ژنوتيب مربوط به تمام جنبههاي فنوتيپ انسان به كليد اصلي صفات انساني دست پيدا خواهند كرد. شناسائي اين ژنها دانشمندان را قادر خواهد ساخت كه به رفع تمام نقائص ژنتيكي انسانها بپردازند و نيز منشاء تمام حالات جسمي و روحي و رفتاري انسان را شناسائي كرده و در دست خود بگيرند.
هماكنون ژنهاي جديدي براي اختلالات جسمي و حتي روحي مانند بيماريهاي قلبي و عروقي، اسيكزوفرني و… شناسائي شده است و پيمودن اين راه باسرعت هرچه تمام ادامه دارد. اينك قدمهاي زيادي به انتهاي اين مرحله سرنوشتساز از تاريخ بشر باقي نمانده است و همگي دانشمندان منتظر بهثمر رسيدن دستاوردهاي اين پروژه در آينده بسيار نزديك ميباشند.
يكي از ابزارها و شاخههاي بيوتكنولوژي كه اخيراً به شكوفائي رسيده است بيوانفورماتيك ميباشد كه كار تجزيه و تحليل دادههاي بدست آمده از HGP و… را انجام داده و آنها را تبديل به اطلاعات باارزش و قابل استفاده براي دانشمندان مختلف مينمايد.
موضوع مرتبط با اين امر موضوع كشف SNP ها ميباشد. SNPها تفاوتهاي تكنوكلئوتيدي هستند كه بين دو فرد، از نظر يك ژن بين آنها وجود دارد. شناسائي اين تفاوتها ارزش فراواني دارد. چراكه بطور مثال فردي كه داراي هوش بيشتر يا دندان مستحكمتر نسبت به فرد ديگري است ممكن است تنها در يك نوكلئوتيد از يك ژن با يكديگر تفاوت داشته باشند و شناسائي مكان و نوع اين تفاوت ارزش اقتصادي زيادي براي كاشف و انحصارگر آن دارد. بهمين دليل هماكنون شكارچيان ژن درحال شناسايي قومها و نژادهائي هستند كه در يك يا چند زمينه خاص داراي خصوصيات برتر ميباشند.
پروتئوميكس Proteomics
دنياي پروتئوميكس دنياي بيانتهائي است كه ما هماكنون در روزنه ورودي آن قرار گرفتهايم. دانشمندان بعد از استخراج اطلاعات ژنوم انساني به كاربرد آن در حوزه پروتئوميكس ميانديشند. در پروتئوميكس دانشمندان براساس اصل يك پروتئين يك ژن بدنبال يافتن كليه پروتئينهاي توليد شده در بدن انسان و ربط آن به يك ژن هستند.
پس از اتمام پروژه پروتئوميكس كه حتي بسيار بزرگتر و طولانيتر و پرابعادتر از پروژه ژنوميكس خواهد بود ميتوان گفت كه انسان به عمده اطلاعات حياتي لازم در مورد خود دست يافته است و پس از كاربرد اين اطلاعات در طراحي داروها و فرآيندهاي مناسب تقريباً قادر به مبارزه با هر بيماري و هر اختلال در بدن خود خواهد بود و حتي قادر به پيشگيري از اكثر آنها خواهد شد.
مرحله بعد از (و حتي همگام با) پروتئؤميكس طراحي داروهاي بيولوژيك ميباشد كه دانشمندان را قادر ميسازد پروتئينهاي مزاحم يا ناقص را خنثي كنند يا توليد پروتئينهاي ضروري در بدن را باعث شوند.
بازار پروتئوميكس برعكس ژنوميكس بسيار گستردهتر و غير متمركز بوده و هماكنون بسياري از كشورها حتي كشورهاي جهان سوم مثل برزيل نيز قدم به اين عرصه گذاشتهاند.
كلونينگ انسان
از زماني كه دانشمندان با ابداع روش جديد همانندسازي گوسفندي بنام دالي را خلق كردند اميدها و نگرانيهاي زيادي در جوامع انساني بوجود آمد. بيوتكنولوژيستها توانستند با انتقال محتواي ژنتيكي يك سلول سوماتيك به يك سلول تخم كه محتواي ژنتيكي آن تخليه شده بود به توليد موجوداتي كاملاً مشابه موجود دالي دست يابند. بازار اين فناوري در تكثير دامهايي با خصوصيات ويژه مانند شير زياد يا گوشت مناسب بسيار گسترده است. با اينحال كشيده شدن اين بحث به همانندسازي انسان نگرانيهائي را در كشورهاي مختلف بوجود آمده است. موضوع مرتبط با اين امر توليد موجودات يا ارگانهاي انساني از سلولهاي ريشهاي جنين ميباشد كه همانند كلونينگ داراي مخالفان و موافقان خاص خود ميباشد.
تراشههاي زيستي
تراشههاي زيستي مانند DNA Chips از كاربردهاي نوين و بسيار اغواگر بيوتكنولوژي ميباشد.
در يكي از اين كاربردها دانشمندان توانستهاند با استفاده از رشتههاي DNA به توليد تراشههائي دست بزنند كه سرعت پردازش اطلاعات در آنها در مقايسه با حجم كوچك آنها بسيار بيش از تراشههاي معمولي ميباشد. از كاربردهاي ديگر و اصلي تراشههاي زيستي دو مورد DNA Chips و DNA Microarray ميباشد.
DNA Chips : در اين تكنولوژي بيوتكنولوژيستها با ساختن قطعات اليگو نوكلئوتيدي 20 تا 80 نوكلئوتيدي با تواليهاي متفاوت و تثبيت آن بصورت آرايشي از نقاط بسيار ريز (كمتر از 300 ميكرون) بر روي بستر مناسب (مانند نيتروسلولز يا برخي فلزات و مواد پلاستيكي) و سپس مجاور كردن نمونههاي DNA مجهول با اين نقاط تثبيت شده شرايط يك واكنش هيبريديزاسيون را بوجود ميآورند. در صورتيكه بين سكانس مجهول و سكانس معلوم هر يك از اليكونوكلئوتيدها واكنش هيبريداسيون صورت گيرد ميتوان پيبه سكانس DNA مجهول برد.
از اين روش همچنين براي تعيين ميزان بيان پروتئين يا فراواني نيز استفاده ميشود. اين روش توسط شركت Affymetryx ابداع شده است.
DNA Microarray : در اين تكنولوژي پروب cDNA (با طول بين 500 تا 5000 باز) بر روي بستر جامد مناسب تثبيت بود و سپس اين نقاط تثبيت شده در معرض نمونههاي DNA مجهول قرار ميگيرد. اين روش در دانشگاه استانفورد ابداع شده است.
كاربرد هر دو روش كه تاحد زيادي مشابه هم هستند در كشف ژنها، در تشخيص بيماريها، در علم فارماكوژنوميك و در علم توكيكوژونوميك و… ميباشد
انتقال ژن در گیاه
سال پیش استفاده از Agrobacterium tumefaciens به عنوان ناقلی برای خلق گیاهان تراریخته یک رویا بود. امروزه به راحتی با این باکتری انتقال ژن به بسیاری از گونههای مهم زراعی و باغی انجام میشود و تعداد گونههایی که مستعد انتقال ژن با آگروباکتریوم هستند، روز به روز افزایش مییابد.
در تعدادی از کشورهای پیشرفته، سطح وسیعی از مزارع گیاهان مهم اقتصادی مثل ذرت، سویا، کلزا، پنبه، سیبزمینی و گوجه فرنگی به گیاهان تراریخته اختصاص یافته است و روند رو به رشدی در تولید این گیاهان تراریخته با استفاده از آگروباکتریوم، در مقایسه با بمباران ذرهای دیده میشود. اما هنوز چالشهای متعدد مستقل از ژنوتیپ در انتقال ژن به بسیاری از گونههای مهم زارعی و همچنین گونههای جنگلی مورد استفاده در صنایع چوب و کاغذ وجود دارد. به علاوه، ابراز پایدار و قابل پیشبینی ژنهای تراریخته کماکان غامض و پیچیده میباشد. تاکنون در چندین مقاله مروری عالی، جنبههای مختلف زیستشناختی آگروباکتریوم، با جزییات شرح داده شده است.
در این مقاله، نویسنده توضیح میدهد که چگونه دانشمندان با استفاده از دانش پایه زیستشناسی آگروباکتریوم، این باکتری را به عنوان ابزاری در مهندسی ژنتیک گیاهی توسعه میدهند. نویسنده همچنین در جستجوی این موضوع است که چگونه درک رو به گسترش ما از زیستشناسی آگروباکتریوم به ما در توسعه کاربرد انتقال ژن به واسطه این باکتری کمک میکند. وی عقیده دارد که بهبود فناوری انتقال ژن نیاز مبرمی به دستورزی این فرآیندهای بنیادی زیستشناختی خواهد داشت.
طبقهبندی جنس آگروباکتریوم و طیف میزبانی
جنس آگروباکتریوم به تعدادی گونه تقسیم میشود. این تقسیمبندی عمدتاً بر اساس علائم حاصل از بیماری و طیف میزبان میباشد. بنابراین، A. radiobacter یک گونه غیر بیماریزا است، A. tumefaciens عامل بیماری گال تاجی، A. rhizogenes عامل بیماری ریشه مویی و A. rubi عامل بیماری گال نیشکر میباشد. به تازگی یک گونه جدید به نام A. vitis که عامل ایجاد گال در انگور و تعداد دیگری گیاه است، نیز پیشنهاد شده است. گرچه Bergey's Manual of Systematic Bacteriology هنوز این نامگذاری را منعکس مینماید ولی این طبقهبندی پیچیده و گیجکننده است. ما میدانیم که در اکثر موارد، علائم بیماری یاد شده حاصل از نوع پلاسمید مولد تومور است که در درون سویه خاصی وجود دارد. از دست دادن پلاسمید مولد تومور یا جایگزینی آن با پلاسمید دیگر، میتواند باعث تغییر علائم بیماری شود. به عنوان مثال، آلودگی گیاهان با A. tumefaciens C58 که دارای پلاسمید pTiC58 از دسته پلاسمیدهای نوپالین میباشد، باعث ایجاد گال تاجی جنینی میشود. اگر این پلاسمید حذف شود، این سویه باکتری غیر بیماریزا میشود. وارد کردن پلاسمید Ri به این سویه که پلاسمید خود را از دست داده است، باعث تبدیل باکتری به سویه A. rhizogenes می شود. به علاوه، با وارد کردن پلاسمید Ti (القا کننده تومور) از A. tumefaciens به A. rhizogenes، سویه ایجاد شده تومورهایی با ظاهری تغییریافته در گیاه Kalanchoe ایجاد میکند. بنابراین، چون A. tumefaciens میتواند به راحتی با جانشینی یک نوع پلاسمید سرطانزا با پلاسمید دیگر، به A. rhizogenes تبدیل شود، واژه گونه معنی خود را از دست میدهد. شاید یک سیستم طبقهبندی با معنیتر، جنس آگروباکتریوم را بر اساس خصوصیات متبولیکی و رشد به biovar هایی تقسیم نماید. با استفاده از این سیستم، اکثر سویههای A. tumefaciens و A. rubiبه biovar اول تعلق داشته، سویههای A. rhizogenes biovar دوم را تشکیل داده و biovar سوم نماینده سویههای A. vitis میباشد. سیستم دیگری نیز برای طبقهبندی جنس آگروباکتریوم پیشنهاد شده است. تکمیل توالییابی DNA کل ژنوم A. tumefaciens C58 که مرکب از یک کروموزوم خطی، یک کروموزوم حلقوی، یک پلاسمید Ti و یک پلاسمید بزرگ دیگر میباشد، ممکن است نقطه شروعی برای طبقهبندی مجدد سویههای Agrobacterium در گونههای واقعی گردد. علیرغم سرگردانی موجود در طبقهبندی گونهها، شاید مهمترین موضوع در مهندسی ژنتیک گیاهان، طیف میزبانی سویههای مختلف آگروباکتریوم باشد. به عنوان یک جنس، آگروباکتریوم میتواند DNA را به تعداد قابل ملاحظهای از موجودات زنده شامل بسیاری از دولپهایها و تکلپهایها در گونههای نهاندانه و بازدانگان منتقل نماید. به علاوه، آگروباکتریوم توانایی انتقال ژن به قارچهایی مثل مخمر، آسکومیستها و بازیدومیستها را دارد. در سال 2001 انتقال DNA به سلول انسانی توسط آگروباکتریوم گزارش شده است. اساس مولکولی و ژنتیکی طیف میزبان یک سویه آگروباکتریوم هنوز روشن نشده است. مطالعات اولیه حاکی از این است که پلاسمید Ti در مقایسه با ژنهای کرورموزومی، تعیینکننده ژنتیکی اصلی طیف میزبانی میباشد. نشان داده شده است که چندین مکان ژنی بیماریزایی (vir) بر روی پلاسمید Ti ازجمله virC و virF، در تعیین گونههای گیاهی که انتقال ژن به آنها میتواند صورت گیرد تا تومورهای گال تاجی ایجاد شود، نقش دارند. مشخص شده که مکان ژنی virH که قبلاً pinF نامیده میشد، در توانایی آگروباکتریوم در انتقال ژن به ذرت موثر میباشند. سایر ژنهای vir مثل virG نیز در بیماریزایی بیش از حد برخی سویههای خاص مشارکت دارند.
به هرحال اکنون روشن شده است که طیف میزبانی فرآیند بسیار پیچیدهای میباشد که تحت کنترل ژنتیکی چندی عامل در باکتری و میزبان گیاهی میباشد. نتیجه هر تلاش و تحقیقی برای انتقال ژن به گیاهان مختلف، خصوصاً گیاهان جدید، اطلاعاتی درباره طیف میزبانی آگروباکتریوم به ما میدهد. به طور مثال، امروزه انتقال ژن به بسیاری از گونههای گیاهان تکلپه مثل ذرت، برنج، جو و گندم توسط بسیاری از سویههای آگروباکتریوم ممکن شده و و فنوتیپ مقاومت به علفکش و آنتیبیوتیک در آنها ایجاد شده است اما تومور گال تاجی در این گونههای گیاهی رشد نمیکند. شاید طیف میزبانی حاصل برهمکنش پلاسمید Ti خاصی با زمینه کروموزومی باکتریایی مشخصی باشد. به طور مثال، پلاسمید pTiBo542 در سویه طبیعی خود یعنی A. tumefaciens Bo542 قابلیت تومورزایی محدودی بر روی گونههای متعدد بقولات دارد. این پلاسمید اگر در زمینه کروموزومی A. tumefaciens C58 قرار گیرد، باعث بیماریزایی قوی در سویا و سایر بقولات میشود. سرانجام، حساسیت به بیماری گال تاجی، یک اساس ژنتیکی در کدوییان، نخود، سویا، انگور و حتی اکوتیپهای مختلف Arabidopsis thaliana دارد. نقش ژنهای بیماریزایی باکتری و ژنهای میزبان در فرآیند انتقال ژن و راههای دستورزی آنها برای مقاصد مهندسی ژنتیک، در ادامه شرح داده خواهد شد.
T-DNAچیست؟
اساس مولکولی انتقال ژنتیکی به گیاهان توسط آگروباکتریوم انتقال یک منطقه از یک پلاسمید بزرگ القا کننده تومور (Ti) یا ریشهزا (Ri) از آگروباکتریوم و ادغام آن در ژنوم گیاه میباشد
A) T-DNA به سه ناحیه T-DNA چپ (TL)، T-DNA مرکزی (TC) و T-DNA (TR ) راست تقسیم میشود. دایرههای توپر سیاه نشانه توالیهای تکراری حاشیه T-DNA هستند. oriV نقطه شروع همانندسازی پلاسمید Ti با دایره توخال نمایش داده شده است.
B) رونوشتهای متنوع رمزشده توسط T-DNA در پلاسمید Ti و جهت رونویسی آنها با بردارها نمایش داده شده است. ژنها رمزکننده فعالیتهایی شامل ساخت اکسین (auxin)، ساخت سایتوکینین (cyt)، مانوپین (mas) و آگروپین (aga) نشان داده شدهاند.
اندازه پلاسمید Ti 200 تا 800 کیلو باز است. T-DNA یا DNA منتقل شونده در منطقه T بر روی پلاسمید Ti یا Ri قرار دارد. اندازه منطقه T در پلاسمیدهای طبیعی Ti و Ri حدوداً 10 تا 30 کیلو باز است. بنابراین، منطقه T عموماً 10 درصد پلاسمید Ti را شامل میشود. برخی پلاسمیدهای Ti یک منطقه T داشته و برخی دارای چند منطقه T میباشند. فرآیند انتقال T-DNA از پلاسمید Ti و ارسال آن از باکتری به سلول گیاهی حاصل فعالیت ژنهای بیماریزا (vir) میباشد که توسط پلاسمید Ti حمل میشوند.
منطقه T با توالیهای حاشیهای T-DNA معین میشود. این حاشیهها 25 جفت باز طول دارند و از نظر توالی بسیار همسان هستند. آنها منطقه T را با تکرارهای هم جهت از دو طرف در بر گرفتهاند. به طور کلی، کنارههای T-DNA حدود آن را تعیین میکنند (البته موارد استثنایی نیز وجود دارد که به آنها اشاره خواهد شد)، چون این توالیها هدف اندونوکلئازهای اختصاصی کنارهها یعنی VirD1/VirD2 که T-DNA را Ti plasmid جدا میکنند، میباشند. به نظر میرسد که یک قطبیت در کنارههای T-DNA وجود دارد به طوری که در ابتدا به نظر میرسد کناره راست بسیار مهمتر از کناره چپ است. عوامل متعددی باعث ایجاد این قطبیت میشوند. اول اینکه توالیهای حاشیهای فقط به عنوان هدف اندونوکلئاز VirD1/VirD2 عمل نمیکنند بلکه به عنوان یک محل اتصال کووالانت به پروتئین VirD2 نیز عمل میکنند. در پلاسمید Ti و Ri (یا در ناقلهای دوتایی T-DNA) کنارههای T-DNA باعث به هم وصل شدن DNA دورشتهای میشود. شکستن این توالیهای کنارهای دورشتهای شده هم در شرایط in vivo و هم in vitro، نیازمند پروتئیهای VirD1 و VirD2 میباشد، هرچند در شرایط in vitro پروتئین VirD2 به تنهایی میتواند یک توالی تک رشتهای حاشیهای T-DNA را ببرد. شکتن توالی حاشیهای 25 جفت بازی T-DNA عمدتاً با ایجاد شکافی در "رشته پایینی" T-DNA به طور قراردادی، بین نوکلئوتید 3 و 4 صورت میگیرد. شکستن دورشتهای نیز در کنارههای T-DNA گزارش شده است. ایجاد شکاف در توالی حاشیهای با پیوستگی محکم (شاید کووالانت) پروتئین VirD2 از طریق تیروزین موقعیت 29 با انتهای 5' مولکول تکرشتهای حاصل از T-DNA که رشته T خوانده میشود، همراه است. این رشته T است که به جای مولکول دورشتهای T-DNA، به سلول گیاهی منتقل میشود. در این حالت، این پروتئین VirD2 است که به حاشیه راست متصل شده (مستقیماً به خود توالی حاشیه متصل نمیشود) و باعث ایجاد قطبیت و اهمیت حاشیه راست نسبت به حاشیه چپ میشود. ذکر این نکته لازم است که چون شکاف در حاشیه چپ نیز برای اتصال VirD2 به بقیه مولکول لازم است (قسمت غیر T-DNA پلاسمید Ti یا ناقل دوتایی T-DNA) این موضوع ممکن است باعث فرآیند جداسازی رشته T از پلاسمید Ti یا پلاسمید Ri و ناقلین دوتایی T-DNA باشد. مشکل انتقال "بقیه قسمتهای"4 ناقل به گیاه در ادامه شرح داده خواهد شد.
دوم اینکه شاید حضور توالیهای overdrive T-DNA نزدیک به حاشیه راست بسیاری از T-DNAها، نیز به ایجاد قطبیت بین حاشیه چپ و راست کمک نماید. توالیهای overdrive باعث تقویت انتقال رشته T به گیاهان میشوند، گرچه هنوز سازکار مولکولی این موضوع ناشناخته است. گزارشهای اولیه حاکی از این است که پروتئین VirC1 به توالی overdrive متصل میشود و شاید بریده شدنحاشیه T-DNA توسط اندونوکلئاز VirD1/VirD2 را تقویت کنند. عمل VirC1 و virC2 برای بیماریزایی بسیار مهم است و جهش این دو ژن باعث عدم بیماریزایی در بسیاری از گونههای گیاهی میشود. اما گزارشهایی ارائه شده که تولید T-DNA در جهشیافتههای ژن virC آگروباکتریوم را در سطح گونه وحشی دانستهاند. بنابراین هر گونه اثر virC پس از پردازش T-DNA رخ میدهد
همان طور که در مطالب پیشین ذکر شد، بسیاری از پروتئینهایی که توسط ژنهای vir رمز میشوند، نقشی ضروری در فرآیند انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم دارند. برخی از این نقشها در چندین مقاله مروری برجسته شرح داده شده است، بنابراین در مقاله حاضر، نقشهای پروتئینهای Vir که میتوانند با هدف بهبود فرآیند انتقال ژن مورد دستورزی قرار گیرند، به طور محدودتری توضیح داده شده است. پروتئینهای VirA و VirG به عنوان عضوی از یک سیستم تنظیمی ژنتیکی دو بخشی حسیترارسانی پیام عمل میکنند. VirA یک شاخک پریپلاسمیک است که حضور ترکیبات فنلی گیاهی خاصی را در زمان زخم القا میشود، حس میکند. VirA با هماهنگی با یک مولکول حامل مونوساکاریدی به نام ChvE و در حضور مقدار مناسبی فنل و مولکول قند، خود و پروتئین VirG را فسفریله میکند. VirG در حالت غیر فسفریله غیرفعال است، اما در حالت فسفریله، این پروتئین به فعال شدن یا افزایش سطح رونویسی ژنهای vir کمک میکند. این کار احتمالاً از طریق برهمکنش با توالی جعبه-vir که بخشی از راهانداز ژنهای vir است، صورت میگیرد. پروتئینهای همیشه فعال VirA و VirG که نیازی به القاکننده فنلی برای فعالیت خود نداشته یا پروتئینهای VirG که برهمکنش بهتری با توالی جعبه-vir برای فعال کردن ابراز ژنهای vir داشته باشند، شاید برای بهبود کارآیی انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم و طیف میزبانی مفید باشد.
VirD4 به همراه 11 پروتئین VirB، یک سیستم ترشحی نوع 4 که برای انتفال T-DNA و چند پروتئین دیگر Virشامل VirE2 و VirF لازم است، میسازند. شـایـد VirD4 بـه عنــوان یـک پیونـددهنـده عمـل نمـایـد تـا برهمکنــش مـجـمـوعـه T-DNA/VirD2 با سیستم ترشحی رمزشده VirB را افزایش دهد. بیشتر پروتئینهای VirB یا کانال غشایی میسازند یا به عنوان ATPase، انرژی لازم برای تشکیل کانال یا فرآیندهای خروج مولکولها را فراهم میکنند. چندین پروتئین شامل VirB2، VirB5 و احتمالاً VirB7 در ساختن T-pilus شرکت دارند. VirB2 اصلیترین پروتئین پیلین است. عمل پیلوس در انتقال T-DNA هنوز روشن نیست، ولی شاید به عنوان کانالی برای عبور T-DNA و پروتئینهای Vir عمل نماید یا شاید فقط به عنوان قلابی برای برقراری ارتباط با سلول گیاهی پذیرنده عمل نمایند و باکتری و گیاه در نزدیکی هم قرار داده تا انتقال مولکولی موثری صورت گیرد. جنبه مهم زیستشناسی پیلوس که شاید در انتقال ژن اهمیت داشته باشد، ناپایداری آن در حرارت است. گرچه حداکثر القا ژنهای vir در دمای 25 تا 27 درجه است، پیلوس برخی از سویههای آگروباکتریوم در دماهای پایینتر (18 تا 20 درجه)، پایدارتر است. آزمایشهای اولیه حاکی از اثر درجه حرارت بر انتقال ژن است. بدین ترتیب، برخی شاید کشت همزمان آگروباکتریوم و سلولهای گیاهی را در دمای پایین و طی چند روز آغازین فرآیند انتقال ژن مورد بررسی قرار دهند.
پروتئینهای VirD2 و VirE2نقشی حیاتی و احتمالاً کاملکننده در انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم بازی میکنند. گفته میشود که این دو پروتئین به همراه رشته T، مجموعهای به نام مجموعه T تشکیل میدهند که شکل انتقال شونده T-DNA میباشد. اینکه این مجموعه داخل باکتری سوار میشود یا نه هنوز مورد مباحثه است. Citovsky و همکارانش نشان دادهاند که VirE2 میتواند داخل سلول گیاهی کار خود را انجام دهد: گیاهان تراریخته توتون که توانایی ابراز VirE2 را کسب کرده بودند، با سویههای جهشیافته virE2 آگروباکتریوم آلوده میشدند. چندین آزمایشگاه نیز نشان دادهاند که VirE2 میتواند در غیاب رشته T به سلول گیاهی منتقل شود و ممکن است که مجموعه VirE2 و رشته T، یا در کانال انتقال باکتری یا داخل سلول گیاهی تشکیل شوند. نتایج تحقیقات جدید حاکی از آن است که شاید VirE2 نقش دیگری نیز در مراحل اولیه فرآیند انتقال ژن دارد: Dumas و همکارانش نشان دادهاند که VirE2 در شرایط in vitro میتواند با مشارکت غشا مصنوعی، کانالی برای انتقال مولکولهای DNA خلق نمایند. بنابراین، ممکن است که یک وظیفه VirE2، تشکیل سوراخی در غشا سیتوپلاسمی برای تسهیل عبور رشته T باشد. به دلیل اتصال VirD2 به انتهای 5' رشته T، این پروتئین ممکن است به عنوان راهنمای این رشته برای عبور از کانال انتقالی نوع 4 عمل نماید. VirD2 همچنین ممکن است در مراحل دیگری از فرآیند انتقال ژن، در داخل سلول گیاهی، نقش داشته باشد. VirD2 دارای توالی "پیام مکانیابی هستهای" (NLS) بوده که ممکن است در هدایت این پروتئین و T-DNA متصل به آن به سوی هسته سلول گیاهی، کمک نماید. توالی NLS در پروتئین VirD2 میتواند مجموعههای T ساختهشده در آزمایشگاه که شامل پروتئینهای گزارشگر نیز میباشند، به هسته سلولهای گیاه، جانور و مخمر هدایت کند.
|
استخراج ژن |
|
|
|
براي جدا كردن ژن از DNA نوتركيب، از همان آنزيم محدودكنندهاي استفاده ميكنيم كه قبلا براي ساختن DNA نوتركيب استفاده كرده بوديم. بهكمك اين آنزيم DNA نوتركيب را به ژن و پلازميد تجزيه ميكنيم. به اين ترتيب در لولهي آزمايش مخلوطي از دو مولكول داريم. يكي ژن و ديگري پلازميد كه بايد از هم تفكيك شوند. تفكيك اين دو بهكمك ” الكتروفوز در ژل “ انجام ميشود. اندازهي ژن از اندازهي پلازميد كوچكتر است و بنابراين در ژل، دو نوار خواهيم ديد كه يكي مربوط به ژن است و ديگري مربوط به پلازميد. در مرحله بعد، مهندسان ژنتيك، مولكولهاي ژن را از ژل استخراج ميكنند. به اين ترتيب انبوهي از نسخههاي ژن مورد نظر از ژل جدا ميشود و براي مصرفهاي مورد استفاده قرار ميگيرد. |
|
الكتروفوز در ژل | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
الكتروفوز در ژل روشي است براي جدا كردن مولكولهاي DNA براساس اندازهي آنها. اين روش براي پروتئينها نيز كاربرد دارد. در الكتروفوز، مولكولها در يك ميدان الكتريكي قرار ميگيرند. مولكولهاي DNA بار منفي دارند و بنابراين به سمت قطب مثبت حركت ميكنند. بين دو قطب + و - ، ژل وجود دارد. ژل، مادهاي است با منافذ ريز و درشت متعدد. مولكولها هنگام حركت، لازم است از اين منافذ عبور كنند. مولكولهاي كوچكتر، سريعتر عبور ميكنند اما مولكولهاي بزرگتر، ديرتر. به اين ترتيب مولكولهاي كوچك و بزرگ از يكديگر جدا ميشوند. هرچه DNA به قطب + نزديكتر باشد، كوچكتر است و هرچه به قطب – نزديكتر باشد، بزرگتر. بعد از آنكه DNA ها از هم جدا شدند جريان برق را قطع ميكنند. به اين ترتيب حركت مولكولها متوقف ميشود. DNAهايي كه هماندازه هستند در كنار يكديگر خواهند ايستاد. از كنارهم قرار گرفتن مولكولهاي DNA هماندازه، نواري تشكيل خواهد شد كه در ژل الكتروفوز قابل مشاهده است. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
بسیاری از محدودیتهای روشهای مختلف اصلاح نباتات ریشه در فقدان ابزارهای مناسب برای مطالعات ژنتیکی دارد .وجود ماهیت کمی صفات اقتصادی در محصولات کشاورزی موجب شد که محیط بسیاری ارز براوردهای ارزشهای اصلاحی را تحت تاًثیر قرار دهد و لذا استفاده از ابزارهائی که حداقل تاثیر پذیری را از محیط دارند گام مؤثری در افزایش پیشرفتهای ژنتیکی مورد استفاده می باشد. مارکرهای مولکولی و اخیر نشانگرهای DNA ابزار مناسبی هستند که بر اساس آن می توان جایگاه ژنی وکروموزمی ژنهای تعیین کننده صفات مطلوب را شناسائی کرد. با دانستن جایگاه یک ژن روی کروموزم می توان از نشانگرهای مجاور آن برای تائید وجود صفت در نسلهای تحت گزینش استفاده نمود.
با در دست داشتن تعداد زیادتر نشانگر می توان نقشه های ژنتیکی کاملتری را تهیه نمود که پوشش کاملی را در تمام کروموزمهای گیاهان به وجود می آورد.استفاده از نشانگرها موجب افزایش اطلاعات مفید و مناسب از جنبه های پایه وکاربردی اصلاح نباتات خواهد گردید .
انتخاب به کمک نشانگرهای مولکولی راه حلی است که دست آورد زیست شناسان مولکولی برای متخصصان اصلاح نباتات می باشد در این روش ژن مورد نظر بر اساس پیوستگی که با یک نشانگر ژنتیکی تشخیص داده و انتخاب می شود و بنابراین به عنوان قدم اول در روش انتخاب به کمک نشانگر باید نشانگرهای پیوسته با ژنهای مورد نظر شناسائی شود. یافتن نشانگرهائی که فاصله آنها از ژن مطلوب کمتر از cm10میباشد به طور تجربی نشان داده شده که در این صورت دقت انتخاب 99/75 درصد خواهد بود لذا داشتن نقشه های ژنتیک اشباع که به طور متوسط دارای حداقل یک نشانگر به ازای کمتر از cm10 فاصله روی کروموزمها باشد از ضروریات امر می باشد.
یکی از پایه های اساسی اصلاح نباتات دسترسی وآگاهی از میزان تنوع در مراحل مختلف پروژه های اصلاحی است . به همین جهت نشانگرهای برآورد مناسبی از فواصل ژنتیکی بین واریته های مختلف را نشان می دهند.
مهندسی ژنتیک گیاهی:
مهندسی ژنتیک گیاهی در رابطه با انتقال قطعه ای DNAبیگانه با کدهای حاوی اطلاعات ژنتیکی مورد نظر از یک گیاه به وسیله پلاسمید، ویروس بحث میکند. زمانی که هیبریداسیون جنسی غیر ممکن است مهندسی ژنتیک پتانسیل انتقال ژن عامل یک صفت مفید را از گونههای وحشی با خویشاوندی دور به یک گونه زراعی برای اصلاح کننده نباتات فراهم میسازد در استفاده از باکتریها در مهندسی ژنتیک از پلاسمیدهای باکتری Ecoli استفاده میشود.
گیاهان تولید شده از طریق مهندسی ژنتیک:
علم مهندسی ژنتیک تکنیکهائی را شامل میشود که بر اساس کار چندین دانشمند که مؤفق به کسب جایزه نوبل شدهاند، پایهگذاری شده است .مهندسی ژنتیکی یک علم افسانهای به نظر میرسد. اما امروزه در سطح وسیع در صنایع بیوتکنولوژی و آزمایشگاه های تحقیقاتی دانشگاهی انجام می گیرد. تکنیکهای مورد استفاده در این عمل به خوبی تعریف شده است. اما بسیاری از ادعاها در مورد مهندسی ژنتیک چندان درست نمیباشد. در این مقاله چگونگی کاربرد تکنیکهای مهندسی ژنتیک و مثالهای مربوطه توصیف شده است. پاسخ بسیاری از سؤالات پیرامون مهندسی ژنتیک در پی این دو توصیف زیر داده خواهد شد ضمناً تعریف بعضی از اصطلاحات در انتهای این مقاله آمده است .
1- مهندسی ژنتیک در گیاهان چگونه صورت می گیرد:
دانشمندان معمولاً از مهندسی ژنتیک در عالم طبیعت در انجام کارهایشان الگو برداری می کنند. مهندسی ژنتیک در عالم طبیعت در یک باکتری خاکزی تحت عنوان آگروباکتریوم تاموفاشین را به کار رفته است. این باکتری شامل یک DNA حلقوی کوچک و آزاد بنام پلاسمید می باشد از پلاسمید این باکتری غالباً برای تغییر ساختار ژنتیکی یک گیاه حساس به بیماری گال استفاده میشود. دانشمندان در گام اول ژنهائی را که یک خصوصیت مطلوب و یا یک صفت اتصالی را کنترل میکنند ،شناسائی می کنند. تا در گام بعدی این ژن مطلوب را به گیاه مورد نظر انتقال دهند. برای انجام چنین کاری در گیاهی که حاوی آن ژن مطلوب هست، ژن مربوطه را را از قطعه DNA آن گیاه با استفاده از آنزیمهای خاصی جدا میکنند. این آنزیمها مانند یک قیچی عمل کرده و نیز پلاسمید حاصل از باکتری آگروباکتریوم را با همان آنزیمها برش می دهند و ایجاد یک قطعه DNA باز می کنند سپس این پلاسمید باز شده را در مجاورت ژن مطلوب قرار داده و با یکدیگر ادغام می کنند و با استفاده از آنزیمهای خاصی اتصالات مربوطه را بین این ژن و پلاسمید انجام میدهند. آنها میتوانند پلاسمیدی را تولید کنند که حاوی این ژن مطلوب میباشد. چنین پلاسمیدی را DNA ی نوترکیب یا RDNA مینامند دانشمندان این مجموعه را (پلاسمید نو ترکیب) به داخل باکتری آگرو باکتریوم بر میگردانند و در نتیجه این باکتری شامل پلاسمید تغییر یافته میشود . مجموعه پلاسمید+ ژن مطلوب+ آگروباکتریوم به گیاه مورد نظر منتقل میشود
بعضی از سلولهای این گیاه، ژن مربوطه را از پلاسمید دریافت کرده و جزء ساختار DNA خودی میکنند. وقتی چنین سلولهای گیاهی در محیطهای کشت رشد داده می شوند، تولید گیاهان کوچکی میکنند که میتوان وجود صفت جدید مورد انتظار از ژن انتقال یافته را در آنها تست کرد. این چنین گیاهانی نامیده میشوند گیاهان تراریخت و باید آزمونهای بیشتری بر روی آنها صورت گیرد
